壯筋續(xù)骨湯對(duì)骨折大鼠血清bFGF和TGFβ1水平的影響和意義

祝漢忠等

[摘要] 目的 研究壯筋續(xù)骨湯對(duì)大鼠股骨骨折后血清堿性成纖維細(xì)胞因子（bFGF）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGFβ1）水平以及骨折愈合的影響。 方法 成年健康雄性Wistar大鼠72只，應(yīng)用電鋸在股骨中段切斷股骨制備骨折動(dòng)物模型，壯筋續(xù)骨湯水煎液灌胃干預(yù)治療。大體解剖觀察骨折局部的愈合情況，組織病理學(xué)觀察骨痂結(jié)構(gòu)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清bFGF和TGFβ1水平。 結(jié)果 解剖觀察發(fā)現(xiàn)，骨折后7d骨折斷端主要為肉芽組織，14d為纖維性骨痂，21d可見(jiàn)骨性骨痂，模型組與治療組未見(jiàn)顯著差異，28d治療組骨痂重塑質(zhì)量明顯優(yōu)于模型組。大鼠血清bFGF和TGFβ1水平，模型組與治療組在骨折后7、14、21d無(wú)顯著差異，在28d治療組明顯高于模型組。 結(jié)論 壯筋續(xù)骨湯可能在骨折愈合后期通過(guò)維持血清bFGF和TGFβ1的水平、增強(qiáng)其活性、減緩其降解而促進(jìn)骨折愈合。

[關(guān)鍵詞] 壯筋續(xù)骨湯；骨折；bFGF；TGFβ1；大鼠

[中圖分類(lèi)號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2014）03-27-04

骨折重塑修復(fù)是一個(gè)極其復(fù)雜的病理生理過(guò)程，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)以復(fù)位、固定、功能鍛煉等物理治療手段為主。從20世紀(jì)80年代才開(kāi)始對(duì)影響骨折愈合的生物因子進(jìn)行研究[1]，近幾年成骨誘導(dǎo)研究成為熱點(diǎn)，并已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用階段[2]。骨折后局部壞死的骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和被吸收的骨基質(zhì)均可向骨折周?chē)尫派L(zhǎng)因子[3]。在眾多細(xì)胞因子中，

堿性成纖維細(xì)胞因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）[4]和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGFβ1）[5]的作用尤為突出。中醫(yī)藥治療骨折有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，許多中藥活性成分有促進(jìn)骨折愈合、修復(fù)和改建作用，黃培軍等[6-7]研究發(fā)現(xiàn)，壯筋續(xù)骨湯聯(lián)合內(nèi)固定療法治療骨折均可獲得較單純內(nèi)固定更好療效，但其作用機(jī)制仍然不甚清楚。本實(shí)驗(yàn)試圖觀察壯筋續(xù)骨湯對(duì)大鼠股骨骨折后血清bFGF和TGFβ1水平影響及其對(duì)骨折愈合促進(jìn)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

成年健康雄性清潔級(jí)Wistar大鼠72只，年齡3個(gè)月，體重230～250g，購(gòu)自青島市藥物檢驗(yàn)所動(dòng)物中心：SCXK（魯）20120010。將動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7d，然后隨機(jī)分為對(duì)照組24只、模型組24只、治療組24只。

1.2 制備骨折模型[8]

應(yīng)用10%水合氯醛腹腔注射（300mg/kg）麻醉動(dòng)物，俯臥固定，碘酒消毒，經(jīng)股外側(cè)切口，分離股前、外側(cè)肌間隔直至股骨，在股骨中段（大轉(zhuǎn)子下1cm）用低速牙科鉆（JBX-NE22，NSK Co. Ltd. Japan）鋸斷股骨，應(yīng)用克氏針（直徑1mm）髓腔逆行固定，然后逐層縫合，噴灑青霉素注射液，無(wú)菌包扎切口，手術(shù)成功率100%。對(duì)照組動(dòng)物不切斷股骨，然后逐層縫合切口，無(wú)菌包扎切口。術(shù)后即刻拍攝X線片，然后將動(dòng)物放置籠中，每籠1只，單獨(dú)飼養(yǎng)。

1.3 治療方法

壯筋續(xù)骨湯（出自清代醫(yī)學(xué)家趙濂所著《傷科大成》）由壯筋續(xù)骨丹演化而來(lái)，依據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》（國(guó)中醫(yī)藥發(fā)〔2009〕3號(hào)）制備[9]。每副中藥充分煎煮兩次，最終藥液為224mL，含生藥112g，濃度0.5g/mL。根據(jù)前期研究結(jié)果證實(shí)，每日1.25g/kg（2.5ml/kg）較為理想[9]。本實(shí)驗(yàn)以1.25g/kg（2.5ml/kg）定量喂養(yǎng)，每日1次，連續(xù)28d。對(duì)照組和模型組同步給予等量的生理鹽水。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

治療后7、14、21、28d，每組各取6只動(dòng)物觀察應(yīng)用一下方法觀察研究。

1.4.1 大體觀察 治療結(jié)束后，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)大鼠應(yīng)用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，完整取出股骨，生理鹽水洗滌殘存血跡，照相記錄骨折愈合情況。

1.4.2 組織病理 將股骨置4%多聚甲醛中固定24h，蒸餾水浸泡4h，再置于20%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液脫鈣15d。然后截取骨折處上、下1.0cm部位的組織（包括血腫、骨痂組織），常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，應(yīng)用切片機(jī)（Leica2015，上海）沿股骨縱軸切片，厚5μm，貼于載玻片。蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察骨痂的組織結(jié)構(gòu)。

1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 動(dòng)物麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血（4mL），普通離心機(jī)4000轉(zhuǎn)/min離心10min，分離血清（2mL）。采用雙抗夾心ELISA試劑盒（Blue Green公司）測(cè)定大鼠血清bFGF和TGFβ1的水平。按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，向特異性抗體包被酶標(biāo)板中每孔加血清標(biāo)本100μL，37℃孵育2h，雙蒸水洗滌5min×3次，加顯色劑顯色2min，雙蒸水洗滌5min×3次，洗板機(jī)拍干，用酶標(biāo)儀（Bio-Rad 550型，美國(guó)）在450nm測(cè)定每孔的吸光度值，根據(jù)樣品的吸光度值在制備標(biāo)準(zhǔn)曲線坐標(biāo)上找出對(duì)應(yīng)的bFGF和TGFβ1濃度（ng/L）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以（）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體解剖觀察

對(duì)照組大鼠骨皮質(zhì)完整（圖1A），模型組大鼠骨折線清晰（圖1F），骨折7d（圖1B）骨折斷端被纖維性肉芽組織包圍（針扎易透），至14d（圖1C）纖維性骨痂形成、變硬（針扎有阻力），至21d（圖1D）纖維性骨痂和軟骨骨痂增多、中心硬度增大（針扎阻力增大），至28d（圖1E）纖維性骨痂逐漸被軟骨和骨性骨痂代替，硬度增大（針扎不透）。治療組大鼠術(shù)后7～21d（圖1G、H、I）骨痂結(jié)構(gòu)與模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)明顯差異，但至28d治療組（圖1J）骨痂硬度較模型組（圖1E）明顯增大（針扎不進(jìn)）。endprint

2.2 組織病理觀察

對(duì)照組大鼠骨質(zhì)結(jié)構(gòu)正常（圖2A），模型組大鼠在骨折當(dāng)天骨折端斷為血腫組織所填充（圖2F），在骨折后7d（圖2B）成纖維細(xì)胞自骨膜下增生長(zhǎng)入骨折間隙，形成肉芽組織，夾雜少量成骨細(xì)胞，并有大量局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，治療組與模型組比較未見(jiàn)明顯差異；至骨折14d（圖2C）骨折端纖維性組

織、成骨細(xì)胞增多，形成大量纖維性骨痂及少量軟骨骨痂，治療組與模型組無(wú)明顯差異；至骨折21d（圖2D）破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞活躍，可見(jiàn)骨重塑腔隙、散在骨小梁形成，至28d（圖2E）骨小梁清晰可見(jiàn)，排列規(guī)則，可見(jiàn)骨皮質(zhì)及骨髓腔。治療組骨架結(jié)構(gòu)在7～21d（圖2G、H、I）與模型組相應(yīng)時(shí)間比較無(wú)顯著性差異，但至28天治療組骨細(xì)胞排列相對(duì)整齊清晰（圖2J），顯著優(yōu)于骨折組（圖2E）。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)

2.3.1 血清bFGF水平 在骨折后7、14、21、28d，對(duì)照組大鼠血清BMP7水平均未見(jiàn)顯著性變化（t=0.36～1.47，P>0.05）。模型組大鼠血清bFGF水平，在骨折后7、14、21d也未見(jiàn)顯著性變化（t=0.19～1.04，P>0.05），但均顯著高于對(duì)照組（t=11.37～13.21，P<0.05），在骨折后28d顯著下降（t=14.68，P<0.05）。治療組大鼠血清bFGF水平在骨折后7、14和21d均無(wú)明顯差異（t=0.38～1.60，P>0.05），骨折后28d顯著下降（t=5.78，P<0.05）。但治療組骨折后28d顯著高于對(duì)照組及模型組（t=10.34～11.42，P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.3.2 血清TGF-β1水平 對(duì)照組大鼠骨折后7、14、21、28d血清TGFβ1水平均未見(jiàn)顯著性變化（t=0.09～0.84，P>0.05）。模型組大鼠血清TGFβ1水平在骨折后7、14、21d也未見(jiàn)顯著性變化（t=0.29～0.38，P>0.05），但均顯著高于對(duì)照組（t=9.02～9.93，P<0.05），在骨折后28d顯著下降（t=7.54，P<0.05）。治療組大鼠血清TGFβ1水平在骨折后7、14、21d均無(wú)明顯差異（t=0.45～0.93，P>0.05），骨折后28d顯著下降（t=5.78，P<0.05）。治療組骨折后28d顯著高于對(duì)照組及模型組（t=6.31～7.25，P<0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

實(shí)驗(yàn)研究表明，bFGF通過(guò)調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖、分化，并改變細(xì)胞產(chǎn)物的合成作用于成骨過(guò)程。bFGF不僅能促進(jìn)骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且可以促進(jìn)毛細(xì)血管的增生，改善局部血液供應(yīng)，促進(jìn)成骨細(xì)胞與支架材料的黏附[10]。Tatsuyama等[4]研究表明，在參與骨折修復(fù)過(guò)程中TGF-β1與bFGF有正協(xié)同作用，TGF-β1是bFGF的調(diào)控因子[11]。聯(lián)合應(yīng)用能協(xié)同刺激成骨細(xì)胞增殖，加速軟骨內(nèi)骨化的進(jìn)程[12]。bFGF在骨折愈合各階段有恒定的基因表達(dá)水平，一般是骨損傷初期表達(dá)強(qiáng)烈，達(dá)到高峰后逐漸減弱。Kawaguchi等[13]研究表明，內(nèi)源性bFGF在骨折后1～3周內(nèi)持續(xù)存在于骨折位點(diǎn)，王立平等[14]研究表明，從骨折后4d至3周內(nèi)，bFGF表達(dá)強(qiáng)烈，隨時(shí)間的推移逐漸減弱，bFGF早期表達(dá)能使骨端各種細(xì)胞分裂、增殖，使血腫機(jī)化形成肉芽組織，后期主要使間質(zhì)細(xì)胞或成纖維細(xì)胞保持增殖活躍狀態(tài)。

根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，骨折愈合過(guò)程可以分為早、中、后三期，根據(jù)辯證論者原則分別以活血化瘀、續(xù)筋接骨、滋補(bǔ)肝腎等方法促進(jìn)骨折愈合。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，骨折是骨的完整性和連續(xù)性中斷，根據(jù)組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)的變化，骨折愈合可分為三階段（血腫機(jī)化、原始骨痂形成、骨痂改造塑型）[1]。國(guó)內(nèi)學(xué)者應(yīng)用中西醫(yī)結(jié)合療法治療骨折取得了較好的臨床療效：黃佩軍[6]應(yīng)用壯筋續(xù)骨湯聯(lián)合鎖定加壓鋼板內(nèi)固定治療脛骨平臺(tái)骨折有效率90%；對(duì)于肱骨骨折骨不連患者，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)單側(cè)多功能外固定支架配合中藥壯筋續(xù)骨湯內(nèi)服，骨折愈合率高達(dá)97.4%[15]。在老年股骨粗隆間骨折的治療中，梁士義等[16]采用動(dòng)力髖螺釘固定配合壯筋續(xù)骨丹治療，療效滿(mǎn)意。劉鐘華等[17]應(yīng)用現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參、川芎、紅花等活血化瘀藥在血腫機(jī)化期可以改善骨折斷端局部血液循環(huán)，為骨痂的形成提供優(yōu)越條件。周秋麗等[18]報(bào)道，在骨痂形成期續(xù)斷、骨碎補(bǔ)參與骨折愈合過(guò)程，主要因其含有膠原、鈣鹽和微量元素，可促進(jìn)蛋白合成代謝，有利于骨質(zhì)修復(fù)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示壯筋續(xù)骨湯在骨折后第1～3周內(nèi)并沒(méi)有提高大鼠血清中bFGF和TGFβ1水平，只是在21d后，能使骨生長(zhǎng)因子繼續(xù)保持較高水平，說(shuō)明壯筋續(xù)骨湯并不能促進(jìn)內(nèi)源性骨生長(zhǎng)因子分泌，在骨折愈合后期通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)源性因生物子活性、延長(zhǎng)其半衰期、減緩其降解速度，維持血清bFGF和TGFβ1的水平，促進(jìn)骨折愈合。

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（收稿日期：2013-12-15）endprint

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（收稿日期：2013-12-15）endprint