祝漢忠等

[摘要] 目的 研究壯筋續骨湯對大鼠股骨骨折后血清堿性成纖維細胞因子（bFGF）和轉化生長因子（TGFβ1）水平以及骨折愈合的影響。 方法 成年健康雄性Wistar大鼠72只，應用電鋸在股骨中段切斷股骨制備骨折動物模型，壯筋續骨湯水煎液灌胃干預治療。大體解剖觀察骨折局部的愈合情況，組織病理學觀察骨痂結構，酶聯免疫吸附試驗檢測血清bFGF和TGFβ1水平。 結果 解剖觀察發現，骨折后7d骨折斷端主要為肉芽組織，14d為纖維性骨痂，21d可見骨性骨痂，模型組與治療組未見顯著差異，28d治療組骨痂重塑質量明顯優于模型組。大鼠血清bFGF和TGFβ1水平，模型組與治療組在骨折后7、14、21d無顯著差異，在28d治療組明顯高于模型組。 結論 壯筋續骨湯可能在骨折愈合后期通過維持血清bFGF和TGFβ1的水平、增強其活性、減緩其降解而促進骨折愈合。

[關鍵詞] 壯筋續骨湯；骨折；bFGF；TGFβ1；大鼠

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）03-27-04

骨折重塑修復是一個極其復雜的病理生理過程，現代醫學以復位、固定、功能鍛煉等物理治療手段為主。從20世紀80年代才開始對影響骨折愈合的生物因子進行研究[1]，近幾年成骨誘導研究成為熱點，并已進入臨床實驗和應用階段[2]。骨折后局部壞死的骨細胞、成骨細胞和被吸收的骨基質均可向骨折周圍釋放生長因子[3]。在眾多細胞因子中，

堿性成纖維細胞因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）[4]和轉化生長因子（transforming growth factor，TGFβ1）[5]的作用尤為突出。中醫藥治療骨折有其獨特優勢，許多中藥活性成分有促進骨折愈合、修復和改建作用，黃培軍等[6-7]研究發現，壯筋續骨湯聯合內固定療法治療骨折均可獲得較單純內固定更好療效，但其作用機制仍然不甚清楚。本實驗試圖觀察壯筋續骨湯對大鼠股骨骨折后血清bFGF和TGFβ1水平影響及其對骨折愈合促進作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

成年健康雄性清潔級Wistar大鼠72只，年齡3個月，體重230～250g，購自青島市藥物檢驗所動物中心：SCXK（魯）20120010。將動物適應性飼養7d，然后隨機分為對照組24只、模型組24只、治療組24只。

1.2 制備骨折模型[8]

應用10%水合氯醛腹腔注射（300mg/kg）麻醉動物，俯臥固定，碘酒消毒，經股外側切口，分離股前、外側肌間隔直至股骨，在股骨中段（大轉子下1cm）用低速牙科鉆（JBX-NE22，NSK Co. Ltd. Japan）鋸斷股骨，應用克氏針（直徑1mm）髓腔逆行固定，然后逐層縫合，噴灑青霉素注射液，無菌包扎切口，手術成功率100%。對照組動物不切斷股骨，然后逐層縫合切口，無菌包扎切口。術后即刻拍攝X線片，然后將動物放置籠中，每籠1只，單獨飼養。

1.3 治療方法

壯筋續骨湯（出自清代醫學家趙濂所著《傷科大成》）由壯筋續骨丹演化而來，依據《醫療機構中藥煎藥室管理規范》（國中醫藥發〔2009〕3號）制備[9]。每副中藥充分煎煮兩次，最終藥液為224mL，含生藥112g，濃度0.5g/mL。根據前期研究結果證實，每日1.25g/kg（2.5ml/kg）較為理想[9]。本實驗以1.25g/kg（2.5ml/kg）定量喂養，每日1次，連續28d。對照組和模型組同步給予等量的生理鹽水。

1.4 評價指標

治療后7、14、21、28d，每組各取6只動物觀察應用一下方法觀察研究。

1.4.1 大體觀察 治療結束后，在相應時間點大鼠應用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，完整取出股骨，生理鹽水洗滌殘存血跡，照相記錄骨折愈合情況。

1.4.2 組織病理 將股骨置4%多聚甲醛中固定24h，蒸餾水浸泡4h，再置于20%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液脫鈣15d。然后截取骨折處上、下1.0cm部位的組織（包括血腫、骨痂組織），常規乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，應用切片機（Leica2015，上海）沿股骨縱軸切片，厚5μm，貼于載玻片。蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察骨痂的組織結構。

1.4.3 酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 動物麻醉后，經腹主動脈取血（4mL），普通離心機4000轉/min離心10min，分離血清（2mL）。采用雙抗夾心ELISA試劑盒（Blue Green公司）測定大鼠血清bFGF和TGFβ1的水平。按試劑盒說明書操作，向特異性抗體包被酶標板中每孔加血清標本100μL，37℃孵育2h，雙蒸水洗滌5min×3次，加顯色劑顯色2min，雙蒸水洗滌5min×3次，洗板機拍干，用酶標儀（Bio-Rad 550型，美國）在450nm測定每孔的吸光度值，根據樣品的吸光度值在制備標準曲線坐標上找出對應的bFGF和TGFβ1濃度（ng/L）。

1.5 統計學處理

應用SPSS11.0統計軟件處理，計量資料以（）表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體解剖觀察

對照組大鼠骨皮質完整（圖1A），模型組大鼠骨折線清晰（圖1F），骨折7d（圖1B）骨折斷端被纖維性肉芽組織包圍（針扎易透），至14d（圖1C）纖維性骨痂形成、變硬（針扎有阻力），至21d（圖1D）纖維性骨痂和軟骨骨痂增多、中心硬度增大（針扎阻力增大），至28d（圖1E）纖維性骨痂逐漸被軟骨和骨性骨痂代替，硬度增大（針扎不透）。治療組大鼠術后7～21d（圖1G、H、I）骨痂結構與模型組相應時間點比較無明顯差異，但至28d治療組（圖1J）骨痂硬度較模型組（圖1E）明顯增大（針扎不進）。endprint

2.2 組織病理觀察

對照組大鼠骨質結構正常（圖2A），模型組大鼠在骨折當天骨折端斷為血腫組織所填充（圖2F），在骨折后7d（圖2B）成纖維細胞自骨膜下增生長入骨折間隙，形成肉芽組織，夾雜少量成骨細胞，并有大量局部炎性細胞浸潤，治療組與模型組比較未見明顯差異；至骨折14d（圖2C）骨折端纖維性組

織、成骨細胞增多，形成大量纖維性骨痂及少量軟骨骨痂，治療組與模型組無明顯差異；至骨折21d（圖2D）破骨細胞、成骨細胞活躍，可見骨重塑腔隙、散在骨小梁形成，至28d（圖2E）骨小梁清晰可見，排列規則，可見骨皮質及骨髓腔。治療組骨架結構在7～21d（圖2G、H、I）與模型組相應時間比較無顯著性差異，但至28天治療組骨細胞排列相對整齊清晰（圖2J），顯著優于骨折組（圖2E）。

2.3 酶聯免疫吸附檢測

2.3.1 血清bFGF水平 在骨折后7、14、21、28d，對照組大鼠血清BMP7水平均未見顯著性變化（t=0.36～1.47，P>0.05）。模型組大鼠血清bFGF水平，在骨折后7、14、21d也未見顯著性變化（t=0.19～1.04，P>0.05），但均顯著高于對照組（t=11.37～13.21，P<0.05），在骨折后28d顯著下降（t=14.68，P<0.05）。治療組大鼠血清bFGF水平在骨折后7、14和21d均無明顯差異（t=0.38～1.60，P>0.05），骨折后28d顯著下降（t=5.78，P<0.05）。但治療組骨折后28d顯著高于對照組及模型組（t=10.34～11.42，P<0.05）。見表1。

2.3.2 血清TGF-β1水平 對照組大鼠骨折后7、14、21、28d血清TGFβ1水平均未見顯著性變化（t=0.09～0.84，P>0.05）。模型組大鼠血清TGFβ1水平在骨折后7、14、21d也未見顯著性變化（t=0.29～0.38，P>0.05），但均顯著高于對照組（t=9.02～9.93，P<0.05），在骨折后28d顯著下降（t=7.54，P<0.05）。治療組大鼠血清TGFβ1水平在骨折后7、14、21d均無明顯差異（t=0.45～0.93，P>0.05），骨折后28d顯著下降（t=5.78，P<0.05）。治療組骨折后28d顯著高于對照組及模型組（t=6.31～7.25，P<0.05）。見表2。

3 討論

實驗研究表明，bFGF通過調節成纖維細胞和成骨細胞的增殖、分化，并改變細胞產物的合成作用于成骨過程。bFGF不僅能促進骨細胞的生長，而且可以促進毛細血管的增生，改善局部血液供應，促進成骨細胞與支架材料的黏附[10]。Tatsuyama等[4]研究表明，在參與骨折修復過程中TGF-β1與bFGF有正協同作用，TGF-β1是bFGF的調控因子[11]。聯合應用能協同刺激成骨細胞增殖，加速軟骨內骨化的進程[12]。bFGF在骨折愈合各階段有恒定的基因表達水平，一般是骨損傷初期表達強烈，達到高峰后逐漸減弱。Kawaguchi等[13]研究表明，內源性bFGF在骨折后1～3周內持續存在于骨折位點，王立平等[14]研究表明，從骨折后4d至3周內，bFGF表達強烈，隨時間的推移逐漸減弱，bFGF早期表達能使骨端各種細胞分裂、增殖，使血腫機化形成肉芽組織，后期主要使間質細胞或成纖維細胞保持增殖活躍狀態。

根據傳統中醫理論，骨折愈合過程可以分為早、中、后三期，根據辯證論者原則分別以活血化瘀、續筋接骨、滋補肝腎等方法促進骨折愈合。現代醫學認為，骨折是骨的完整性和連續性中斷，根據組織學和細胞學的變化，骨折愈合可分為三階段（血腫機化、原始骨痂形成、骨痂改造塑型）[1]。國內學者應用中西醫結合療法治療骨折取得了較好的臨床療效：黃佩軍[6]應用壯筋續骨湯聯合鎖定加壓鋼板內固定治療脛骨平臺骨折有效率90%；對于肱骨骨折骨不連患者，現代醫學單側多功能外固定支架配合中藥壯筋續骨湯內服，骨折愈合率高達97.4%[15]。在老年股骨粗隆間骨折的治療中，梁士義等[16]采用動力髖螺釘固定配合壯筋續骨丹治療，療效滿意。劉鐘華等[17]應用現代藥理學研究表明，丹參、川芎、紅花等活血化瘀藥在血腫機化期可以改善骨折斷端局部血液循環，為骨痂的形成提供優越條件。周秋麗等[18]報道，在骨痂形成期續斷、骨碎補參與骨折愈合過程，主要因其含有膠原、鈣鹽和微量元素，可促進蛋白合成代謝，有利于骨質修復。本次實驗結果顯示壯筋續骨湯在骨折后第1～3周內并沒有提高大鼠血清中bFGF和TGFβ1水平，只是在21d后，能使骨生長因子繼續保持較高水平，說明壯筋續骨湯并不能促進內源性骨生長因子分泌，在骨折愈合后期通過增強內源性因生物子活性、延長其半衰期、減緩其降解速度，維持血清bFGF和TGFβ1的水平，促進骨折愈合。

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