兔頸動脈外膜剝離血管出血的動物模型

秦丹丹　萬圣云　丁洋　詹焱青

[摘要] 目的 建立一個穩定的血管外膜剝離出血的動物模型，用于臨床進一步研究局部止血藥物的效果。 方法 取健康新西蘭大白兔12只，隨機按膠原酶濃度分為1 g/L、2 g/L、4 g/L三組，膠原酶消化兔頸動脈至動脈外膜疏松，眼科鑷鈍性剝離外膜，在剝離過程中出現血管滲血，觀察對比不同濃度膠原酶消化后動脈出血量的變化，并取消化前后的頸動脈行HE染色，光鏡下觀察外膜剝離程度，以確定膠原酶最佳消化濃度及剝離程度。 結果 1g/L的膠原酶消化動脈外膜不徹底，無法造成動脈穩定的出血，4 g/L的膠原酶導致血管消化過度破裂出血，2 g/L的膠原酶消化血管外膜+眼科鑷鈍性剝離可使血管外膜剝離徹底，血管出血穩定。 結論 膠原酶消化+眼科鑷鈍性剝離血管外膜的方法可建立穩定的血管出血模型，其最佳消化濃度為2 g/L。

[關鍵詞] 膠原酶；兔頸動脈；外膜剝離；血管出血模型

[中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2014）08-0001-03

目前臨床上局部止血藥物較多[1，2]，效果不一，臨床上對止血藥物效果的評估缺乏一種理想的出血模型，Kunio等[3]、Rall等[4]采用外科手術直接損傷動脈，導致血管破裂，出現不可控制的出血，牟華明等[5]曾采用刀片刮除的方法去除兔頸動脈外膜，但實驗中發現刀片刮除外膜對血管牽張作用強，導致血管壁破裂出血，無法計量統計。本研究即嘗試建立一個穩定的出血模型，用以對臨床上應用的局部止血藥物效果進行評估，以指導臨床實踐。

1 資料與方法

1.1 一般資料

健康新西蘭大白兔12只，雌雄各半，體重2.5～3.0 kg（由安徽醫科大學實驗動物中心提供），實驗動物凝血功能正常，活動不受限制，自由飲水，單籠常規喂養。試劑器材：Ⅱ型膠原酶（美國Sigma公司），眼科鑷，電子天平，石蠟切片機，材料來源、層次相同的10 mm×6 mm干紗條若干。

1.2方法

1.2.1實驗分組 采用隨機數字表法將實驗動物分為三組：1g/L膠原酶組、2 g/L膠原酶組、4 g/L膠原酶組，每組各4只。

1.2.2動物模型建立 取3%戊巴比妥鈉1 mL/kg 沿兔耳緣靜脈靜推麻醉動物。麻醉滿意后，動物取仰臥位，頭部及四肢固定于手術臺上。頸前脫毛后常規碘酒、酒精消毒3遍，鋪洞巾，縱行切開皮膚，逐層分離頸部筋膜及肌肉，暴露雙側頸動脈鞘，仔細游離出雙側頸動脈，長約25 mm，用長25 mm、寬15 mm的膠皮片放置于頸動脈下端，隔開頸動脈和周圍組織，用干紗條迅速擦凈周圍滲出液，采用不同濃度Ⅱ型膠原酶浸濕的紗條外敷左側頸總動脈，共10 min，生理鹽水沖洗、中止消化，用眼科鑷剝離外膜白色疏松組織，直至白色疏松組織消失。用干紗條迅速擦凈周圍滲出液，然后將稱重好的干紗條包裹頸動脈，稱重三組出血60 s的出血量，迅速用生理鹽水沖洗、干紗條擦凈后，再次稱重三組出血60 s的出血量，反復3次，并統計出血量。另一側頸動脈不予膠原酶消化處理，僅放置長25 mm、寬15 mm的膠皮片于頸動脈下端，迅速用干紗條擦凈周圍滲出液，同樣方法放置干紗條稱重3次出血60 s的出血量，作為陰性對照側。

1.2.3取材及固定 稱重結束后立即取出雙側頸動脈，標本截取3段，迅速浸泡于4%多聚甲醛液中固定24 h以上，石蠟包埋固定切片。

1.3組織形態學觀察

標本石蠟包埋后切片，切片按常規進行HE染色，高倍顯微鏡下觀察外膜剝離效果及內膜的病理變化。

1.4 統計學處理

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料（60 s組織出血量）用（x±s）表示，1 g/L濃度的膠原酶實驗側與陰性對照側、2 g/L濃度的膠原酶實驗側與陰性對照側間60 s組織出血量的比較均采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1血管外膜成功剝離

正常兔頸動脈結構分為內膜、中膜及外膜，見圖1A。2 g/L膠原酶消化+眼科鑷剝離可達到外膜基本剝離的效果。HE染色下可見血管外膜結締組織基本剝離，平滑肌層暴露于最外層，見圖1B。而1 g/L組血管外膜剝離不徹底HE染色下可見仍殘留部分結締組織，見圖1 C；4 g/L組血管外膜剝離完全，血管破裂，無法取材。

2.2 眼科鑷刮剝血管外膜至血管廣泛出血

正常兔頸動脈外膜組織學結構主要包括外彈力層、滋養血管、神經末梢及周圍疏松結締組織，如圖2所示。經膠原酶消化后，血管外膜結締組織明顯疏松，易用眼科鑷銳性剝離外膜結締組織，在刮剝的過程中，因外膜結締組織消失，使外膜滋養血管廣泛暴露損傷，最終血管出血，見圖3。

2.3不同濃度膠原酶對血管外膜消化程度影響

1g/L的膠原酶消化動脈外膜不徹底，無法造成動脈穩定出血，1 g/L實驗側60 s出血量與陰性對照側比較，差異無統計學意義（P>0.05），考慮為組織損傷后炎性滲出。2 g/L實驗側膠原酶消化+鈍性剝離血管外膜造成的出血穩定，血管外膜基本剝離，見圖1B，未予任何處理后，出血不能自止，該組實驗側出血量明顯高于陰性對照側，差異有統計學意義（P<0.05）。4 g/L組實驗組60 s出血量大，出血量已超過紗條吸附液體量，無法進行定量統計，且實驗動物迅速死亡。見表1。

3 討論

外科手術中，術中出血不可避免，然而減少出血量，縮短手術時間，對手術預后有重要影響，而局部止血藥的應用在其中起重要作用。目前局部止血藥物種類繁多，缺乏一種理想的局部出血模型來評價局部止血藥物的效果。

相關文獻[5-8]報道，動脈壁是一個有序的層狀結構，分為內膜、中膜及外膜。外膜組織學結構主要包括外彈力層、滋養血管、神經末梢及周圍疏松結締組織。血管結締組織內包括膠原、彈性蛋白和多種組織細胞（巨噬細胞、成纖維細胞等）。血管外膜具有豐富的滋養血管，主要存在于大動脈的外膜，起營養血管外膜的作用。血管外膜的滋養血管分為外部滋養血管、內部滋養血管以及靜脈滋養血管。血管外膜主要構成了血管的支撐結構和提供滋養血管的作用，全程參與了血管損傷與修復的全過程。

Kunio等[3]、Rall等[4]采用單純的外科手術銳性損傷血管導致血管出血。該手術方法難度較大，由于器械直接損傷血管全層，操作過程中易導致動脈瘤形成、血管直接破裂，出現不可控制出血。國內牟華明等[5]也曾嘗試采用刀片刮除的方法去除血管外膜，由于刀片刮除外膜對血管牽張作用強，易刮傷血管壁造成機械損傷、出血。在預實驗的過程中，研究發現器械直接銳性刮剝血管易導致血管破裂、出血迅速、出血量大、無法定量測定、實驗動物迅速死亡。

湯月霞等[9]、胡遠程等[10]采用膠原酶消化血管外膜方法，發現膠原酶消化血管外膜30 min后，血管外膜變為白色，HE染色下發現外膜較消化前明顯疏松，容易用器械鈍性剝離。剝離至外膜白色疏松組織消失的程度，HE染色下發現外膜基本剝離干凈。

本實驗采用膠原酶消化+眼科鑷剝離血管外膜方法，使血管結構破壞，導致血管出血。考慮到實驗的操作性、實驗數據的量化，我們選取了供血豐富、分支較少、位置相對表淺易暴露的兔頸動脈，在預實驗過程中發現兔頸動脈較腹主動脈、股動脈等大動脈便于操作，暴露充分，對周圍組織影響小，出血量可達滿意效果。

1g/L濃度組實驗側60 s滲出量與陰性對照側相差不大，通過HE染色發現，血管外膜仍殘留部分結締組織，外膜滋養血管未裸露，提示1g/L濃度膠原酶消化血管外膜不徹底，經眼科鑷鈍性剝離后，血管無明顯出血。2 g/L膠原酶組實驗側60 s滲出量與陰性對照側有顯著差異，HE染色發現，血管外膜結締組織剝離徹底，外膜滋養血管廣泛裸露，內膜及中膜無破壞，提示2 g/L膠原酶消化外膜徹底，經眼科鑷鈍性剝離后，外膜滋養血管廣泛出血，出血量穩定，且有統計學意義。4 g/L濃度組60 s出血量已超過紗條吸附液體量，且血管破裂，實驗動物迅速死亡，提示4 g/L膠原酶消化外膜過度。

綜上所述，2 g/L膠原酶消化+眼科鑷鈍性剝離血管外膜可導致外膜滋養血管廣泛破壞，而血管中膜及內膜結構未破壞，出血量及出血速度穩定，實驗操作可重復性及操作性好，因此可以成為一種評估局部止血藥物效果的穩定、理想的出血模型。

[參考文獻]

[1] Vuceli D，Pesko P，Stojakov D，et al. Systemic hemostatic drugs[J]. Acta Chirurgica Iugoslavia，2007，54（1）：177-195.

Kunio等[3]、Rall等[4]采用單純的外科手術銳性損傷血管導致血管出血。該手術方法難度較大，由于器械直接損傷血管全層，操作過程中易導致動脈瘤形成、血管直接破裂，出現不可控制出血。國內牟華明等[5]也曾嘗試采用刀片刮除的方法去除血管外膜，由于刀片刮除外膜對血管牽張作用強，易刮傷血管壁造成機械損傷、出血。在預實驗的過程中，研究發現器械直接銳性刮剝血管易導致血管破裂、出血迅速、出血量大、無法定量測定、實驗動物迅速死亡。

湯月霞等[9]、胡遠程等[10]采用膠原酶消化血管外膜方法，發現膠原酶消化血管外膜30 min后，血管外膜變為白色，HE染色下發現外膜較消化前明顯疏松，容易用器械鈍性剝離。剝離至外膜白色疏松組織消失的程度，HE染色下發現外膜基本剝離干凈。

本實驗采用膠原酶消化+眼科鑷剝離血管外膜方法，使血管結構破壞，導致血管出血。考慮到實驗的操作性、實驗數據的量化，我們選取了供血豐富、分支較少、位置相對表淺易暴露的兔頸動脈，在預實驗過程中發現兔頸動脈較腹主動脈、股動脈等大動脈便于操作，暴露充分，對周圍組織影響小，出血量可達滿意效果。

1g/L濃度組實驗側60 s滲出量與陰性對照側相差不大，通過HE染色發現，血管外膜仍殘留部分結締組織，外膜滋養血管未裸露，提示1g/L濃度膠原酶消化血管外膜不徹底，經眼科鑷鈍性剝離后，血管無明顯出血。2 g/L膠原酶組實驗側60 s滲出量與陰性對照側有顯著差異，HE染色發現，血管外膜結締組織剝離徹底，外膜滋養血管廣泛裸露，內膜及中膜無破壞，提示2 g/L膠原酶消化外膜徹底，經眼科鑷鈍性剝離后，外膜滋養血管廣泛出血，出血量穩定，且有統計學意義。4 g/L濃度組60 s出血量已超過紗條吸附液體量，且血管破裂，實驗動物迅速死亡，提示4 g/L膠原酶消化外膜過度。

綜上所述，2 g/L膠原酶消化+眼科鑷鈍性剝離血管外膜可導致外膜滋養血管廣泛破壞，而血管中膜及內膜結構未破壞，出血量及出血速度穩定，實驗操作可重復性及操作性好，因此可以成為一種評估局部止血藥物效果的穩定、理想的出血模型。

[參考文獻]

[1] Vuceli D，Pesko P，Stojakov D，et al. Systemic hemostatic drugs[J]. Acta Chirurgica Iugoslavia，2007，54（1）：177-195.

Kunio等[3]、Rall等[4]采用單純的外科手術銳性損傷血管導致血管出血。該手術方法難度較大，由于器械直接損傷血管全層，操作過程中易導致動脈瘤形成、血管直接破裂，出現不可控制出血。國內牟華明等[5]也曾嘗試采用刀片刮除的方法去除血管外膜，由于刀片刮除外膜對血管牽張作用強，易刮傷血管壁造成機械損傷、出血。在預實驗的過程中，研究發現器械直接銳性刮剝血管易導致血管破裂、出血迅速、出血量大、無法定量測定、實驗動物迅速死亡。

湯月霞等[9]、胡遠程等[10]采用膠原酶消化血管外膜方法，發現膠原酶消化血管外膜30 min后，血管外膜變為白色，HE染色下發現外膜較消化前明顯疏松，容易用器械鈍性剝離。剝離至外膜白色疏松組織消失的程度，HE染色下發現外膜基本剝離干凈。

本實驗采用膠原酶消化+眼科鑷剝離血管外膜方法，使血管結構破壞，導致血管出血。考慮到實驗的操作性、實驗數據的量化，我們選取了供血豐富、分支較少、位置相對表淺易暴露的兔頸動脈，在預實驗過程中發現兔頸動脈較腹主動脈、股動脈等大動脈便于操作，暴露充分，對周圍組織影響小，出血量可達滿意效果。

1g/L濃度組實驗側60 s滲出量與陰性對照側相差不大，通過HE染色發現，血管外膜仍殘留部分結締組織，外膜滋養血管未裸露，提示1g/L濃度膠原酶消化血管外膜不徹底，經眼科鑷鈍性剝離后，血管無明顯出血。2 g/L膠原酶組實驗側60 s滲出量與陰性對照側有顯著差異，HE染色發現，血管外膜結締組織剝離徹底，外膜滋養血管廣泛裸露，內膜及中膜無破壞，提示2 g/L膠原酶消化外膜徹底，經眼科鑷鈍性剝離后，外膜滋養血管廣泛出血，出血量穩定，且有統計學意義。4 g/L濃度組60 s出血量已超過紗條吸附液體量，且血管破裂，實驗動物迅速死亡，提示4 g/L膠原酶消化外膜過度。

綜上所述，2 g/L膠原酶消化+眼科鑷鈍性剝離血管外膜可導致外膜滋養血管廣泛破壞，而血管中膜及內膜結構未破壞，出血量及出血速度穩定，實驗操作可重復性及操作性好，因此可以成為一種評估局部止血藥物效果的穩定、理想的出血模型。

[參考文獻]

[1] Vuceli D，Pesko P，Stojakov D，et al. Systemic hemostatic drugs[J]. Acta Chirurgica Iugoslavia，2007，54（1）：177-195.