疏肝健脾方藥對非酒精性脂肪性肝病大鼠 Kup ffer細胞 SREBP-1c信號通路相關基因及蛋白表達的影響

韓 莉， 楊欽河， 張玉佩， 徐擁建， 劉益臻， 楊雪松， 金 玲

（1.暨南大學附屬第一醫院， 廣東 廣州 510632； 2.暨南大學醫學院中醫系， 廣東 廣州 510632； 3.暨南大學醫學院組織學與胚胎學教研室， 廣東 廣州 510632）

［藥 理］

疏肝健脾方藥對非酒精性脂肪性肝病大鼠 Kup ffer細胞 SREBP-1c信號通路相關基因及蛋白表達的影響

韓 莉1， 楊欽河2*， 張玉佩2， 徐擁建2， 劉益臻2， 楊雪松3， 金 玲1

（1.暨南大學附屬第一醫院， 廣東 廣州 510632； 2.暨南大學醫學院中醫系， 廣東 廣州 510632； 3.暨南大學醫學院組織學與胚胎學教研室， 廣東 廣州 510632）

目的 觀 察 疏 肝 健 脾 方 藥 對 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 病 （ NAFLD） 大 鼠 Kupffer細 胞 固 醇 調 節 元 件 結 合 蛋 白-1c（SREBP-1c） 信號通路相關基因及蛋白表達的影響及可能的機制。 方法 采用高脂飼料喂養復制大鼠 NAFLD模型，各藥物干預組灌飼相應的疏肝健脾方藥，8周后檢測血液常規生化指標，觀察肝組織病理形態改變；采用離體循環灌注Ⅳ型膠原酶法提取肝 臟 Kupffer細胞， Q-PCR及 Western blot法檢 測 Kupffer細胞 SREBP-1c、 硬 脂酰輔酶 A去飽合酶-1 （ SCD-1） mRNA及蛋白 表 達 水 平。 結 果 模 型 組 大 鼠 肝 臟 脂 肪 蓄 積； 血 脂 及 Kupffer細 胞 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA及蛋白表達水平較正常組均顯著升高 （ P＜0.01 ） ； 各藥物干預組 Kupffer細胞 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA及蛋白表達水平均有不同程度的下調，同時血脂及病理學改變也較模型組有不同程度的改善， 以疏肝組作用最為顯著 （P＜0.01） 。 結論 疏肝健脾方藥可能是通過抑制 Kup ffer細胞 SREBP-1c/SCD-1 信號通路激活， 下調血清總膽固醇、 甘油三酯合成， 減少肝臟脂質沉積， 發揮抗 NAFLD作用。 可推測 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA及蛋白可能是疏肝健脾方藥抗NAFLD的有效作用靶點。

疏肝健脾方藥； 非酒精性脂肪性肝病； 固醇調節元件結合蛋白-1c； 硬脂酰輔酶 A去飽和酶-1； Kup ffer細胞；大鼠

非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 病 （ nonalcoholic fatty liver disease， NAFLD） 是一種與遺傳-環境-代謝應激相關且無過量飲酒史、肝細胞脂肪變性和脂質貯積為特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝、非酒精 性 脂 肪 性 肝 炎 （ nonalcoholic steatohepatitis，NASH） 及 NASH相關肝纖維化、 肝硬化。 其發病非單一因素引起，可能與脂質代謝障礙、胰島素抵抗、線粒體功能障礙、2型糖尿病、高血壓和其他一些代謝癥候群等密切相關［1-3］。 固醇調節 元件結合蛋白-1c（ sterol regulatory element binding proteins-1c， SREBP-1c） 和 硬 脂 酰 輔 酶 A 去 飽 和 酶-1（stearyl-CoA desaturase-1， SCD-1 ） 是 參 與脂 肪 酸合成代謝過程的重要調控因子。 研究表明， NAFLD時肝臟 SREBP-1c可激活下游多種參與脂肪酸和甘油三酯合成酶的轉錄， 包括 SCD-1、 脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A羧化酶等，導致脂肪酸合成增加，造成肝臟脂質蓄 積［4］。 本 課 題組前期研 究 發 現，疏肝健脾方藥可顯著改善 NAFLD大鼠肝臟脂質代謝紊亂， 減輕肝臟脂肪變性， 防治 NAFLD作用療效確切［5-7］。 本 實 驗 觀 察 疏 肝 健 脾 方 藥 對 NAFLD大鼠肝臟 Kupffer細胞 SREBP-1c/SCD-1 信號通路相關基因和蛋白表達的影響， 探討其抗 NAFLD的干預作用機制。

1 材料

1.1 動物 雄性 SD大鼠， SPF級， 6 周齡， 體質量 （200 ±20） g， 廣州中醫藥大學實驗動物管理中心提供，動物生產許可證號： SCXK （粵） 2008-0020， 合格批號 0107792。

1.2 主要儀器與試劑 AU600 全自動生化分析儀（日本 Olympus公司） ； ELITE流式細 胞儀 （ 美國BECKMAN-COULTER公司）； KDS200 雙通道注射泵 （美國 KD Scientific公司）； CFX Manager實時熒光定量 PCR儀 （美國 BIO-RAD公司）。 Trizol裂解液 （批號 D9108A）、 Quant cDNA第一鏈合成試劑盒 （ 批 號 DRR047A）、 SYBR Green 熒光 定 量PCR試劑盒 （批號 DRR820A）均購自日本 Takara公 司； SREBP-1c Antibody（ 批 號 GR111569-1 ）、SCD-1 Antibody（ 批 號 GR91951-1 ） 均 購 自 美 國Abcam公司； 兔抗大鼠 Anti-Lysozyme（批號 Y-Bo-07J26C）購自武漢博士德生物技術有限公司； Ⅳ型膠原酶 （ 批號 C8160-100） 購自美國 GBICO公司； Nycodenz細胞分離液 （批號 1002424-1） 購自瑞典 Axis-shield 公司。

1.3 實驗藥材 方藥組成及飲片劑量均參照 《方劑學》 教 材［8］。 疏 肝 方 藥 （ 柴 胡 疏 肝 散： 柴 胡6 g， 川芎5 g， 枳殼 5 g， 陳皮 6 g， 白芍5 g， 香附5 g，炙甘草 3 g）、健脾方藥 （參苓白術散：人參15 g， 白術 15 g， 茯苓 15 g，薏苡仁9 g， 砂仁 6 g，山藥 15 g， 桔梗 6 g， 白扁豆 12 g， 蓮子 9 g， 炙甘草 9 g）、 合方 （柴胡疏肝散與參苓白術散合用方）中藥材均為深圳華潤三九醫藥股份有限公司生產的免煎單味中藥配方顆粒，購自暨南大學附屬第一醫院中藥房。免煎中藥配方顆粒按包裝說明換算成實驗所需的飲片劑量，溶于水制成水溶劑。其中疏肝方 含 生 藥 量 0.96 g/mL； 健 脾 方 含 生 藥 量3.00 g/mL； 合方含生藥量 3.96 g/mL。

2 方法

2.1 動物分組及處理 將大鼠隨機分為正常組、 模型組、 疏肝組、健脾組、合方組， 每組 15 只。NAFLD大鼠模型建立在本課題組以往的造模方法［9］的基礎上加以改進， 建立 NAFLD大鼠模型。 除正常組大鼠給予基礎飼料喂養外，其余各組大鼠均以高脂飼料 （基礎飼料 88%，豬油10%， 膽固醇 1.5%，3 號 膽 鹽 0.5%） 喂 養 造 模。 同 時 各 組 按10 mL/（kg體質量）給予相應的藥物或蒸餾水灌胃。本課題組前期［10］已探討不同疏肝健脾方藥劑量對NAFLD大鼠的干預作用， 表明人臨床等效劑量的3倍用量在改善 NAFLD大鼠肝功能，降低血脂、肝脂，減輕肝臟脂肪變性療效更為顯著。因此本實驗采用成人臨床等效劑量的3倍用量，疏肝組為9.6 g/（kg·d），健脾組為 30 g/（kg·d），合方組為39.6 g/（kg·d）。 每日上午 8 ∶00 灌胃 1 次，1周稱體質量1次，根據體質量調整給藥劑量，連續8 周。 各組動物分籠飼養于 22 ～26 ℃， 明暗各12 h的動物實驗室內， 自由飲水進食。 實驗期間觀察大鼠毛色、體態、食欲、行為狀態、大小便及對外界刺激的反應。

2.2 標本采集 第 8 周后， 禁食 12 h， 每組 8 ～9只大鼠 （注：因灌胃不當，正常組、模型組、健脾組及合方組大鼠各死亡1只）以 3%戊巴比妥鈉按 0.1 mL/（kg體質量）腹腔麻醉， 腹主動脈采血，距離肝邊緣 0.5 cm處取相同部位肝右葉組織若干，-80 ℃低溫冰箱保存備用。 其余 6 只用以分離Kupffer細胞。

2.3 肝組織觀察 距離肝邊緣 0.5 cm處取相同部位肝右葉小塊約 1.5 cm×1 cm×0.5 cm， 冰凍切片作油紅O染色觀察肝細胞內脂滴的分布情況。另若干小塊以 10%中性甲醛溶液固定， 常規石蠟包埋， 作4μm連續切片行 HE染色， 光鏡下觀察大鼠肝臟脂肪變性情況。需要注意的是脂滴極易降解，因此取肝組織后應當日即行油紅O染色。

2.4 血脂檢測 采用全自動生化分析儀檢測血清血清總膽固醇 （TC）、 甘油三酯 （TG）、 高密度脂蛋白 膽 固 醇 （ HDL-C）、 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇（LDL-C）水平。

2.5 Kupffer細胞分離及鑒定 采用離體循環灌注Ⅳ 型 膠 原 酶 法 提 取 Kupffer細 胞， 流 式 細 胞 術（flow cytometry， FCM） 鑒定細胞純度， 具體分離與鑒定 方 法 詳見本課 題 組 已 發 表 論 文［11］， 不 再贅述。

2.6 Q-PCR法檢測 Kupffer細胞 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA表達水平 采用 Trizol裂解肝細胞， 提取總RNA，分光光度計檢測總 RNA水平，然后逆轉錄為 cDNA。 引物設計依據 Genebank 采用 Primer 5.0軟件以 GAPDH基因序列為內參照物， 由上海捷瑞生物工程有限公司合成， 引物序列見表 1。 PCR擴增采用25 μL反應體系，反應條件為90 ℃預變性，持 續 30 min； 95 ℃ 變 性， 持 續 5 s； GAPDH、 SREBP-1c、 SCD-1 均為 58 ℃， 退火 20 s； 60 ℃延伸， 持續 45 s， 39 個循環； 溶解曲線分析， 65 ～95 ℃， 持續 5 ～10 s。 反應完畢， 用 Opticon Monitor 3.1 軟件處理結果， 設定正常組基因表達水平為 1。 公式 2-ΔΔCt=實驗組目的基因表達相對于正常組 的 變 化 倍 數。 ΔΔCt=實 驗 組 （ Ct目的基因-Ct內參基因） -空白組 （Ct目的基因-Ct內參其因）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.7 Western blot法檢測 Kupffer細 胞 SREBP-1c、SCD-1 蛋白表達水平 每 5 ×106個細胞加入 1 mL RIPA裂 解 液 （含 PMSF） ， 吹 打 混 勻 后，4 ℃，14 000 r/min，離心 8 min，取 上 清 BCA法 測 定 總蛋白濃度， 調整樣品上樣量終質量濃度為 50～80 μg/μL。 注意為避免蛋白降解， 全程都應在冰臺上操作。 經 SDS-PAGE電泳分離蛋白， 然后轉移至 PVDF膜上， 加 5%脫脂奶粉封閉液， 室溫下平搖1 h； 洗膜， 加一抗稀釋液4℃過夜孵育； 洗膜， 加二抗稀釋液室溫孵育1 h， 洗膜后， 進行化學發光反應。 用 Quantity One軟件分析內參與目的蛋白的光密度值，統計分析。

2.8 統 計 學 處 理 計 量 資 料 以 均 數 ±標 準 差（） 表 示， 采 用 SPSS 19.0 進 行 統 計 學 處 理，組間均數比較采用單因素方差分析，方差齊時用SNK （ Student-Newman-Keuls， 即 q檢 驗 ） 法 進 行組間兩兩比較， 方差不齊時用 Tamhane’s T2 檢驗，檢驗水準 P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 動物一般狀況 正常組大鼠毛色光澤，飲食、排泄物較正常，性情溫順，對外界刺激反應靈敏。模型組大鼠體毛略黃而干枯，體型肥胖，大便油膩感質略稀，對外界刺激反應遲鈍，容易激惹。各用藥組大鼠一般情況介于正常組和模型組大鼠之間。

3.2 肝組織病理學觀察

3.2.1 油紅 O染色結果 正常組大鼠肝細胞核呈淡藍染色，少許肝細胞胞漿內可見散在的紅染脂滴。模型組大鼠肝細胞腫脹，細胞核呈深藍染色，細胞漿可見大量紅色脂滴，少許肝細胞脂滴融合成大脂滴。各藥物干預組大鼠肝細胞脂滴紅染情況與模型組相比明顯縮小和減少，其中以疏肝組大鼠肝細胞含脂滴量與正常組最為接近。 見圖1。

圖 1 各組大鼠肝組織病理變化 （油紅 O染色 ×200）Fig.1 Histopathological changes of liver tissuesw ith oil red O staining in each group（ ×200）

3.2.2 HE染色結果 正常組大鼠肝小葉輪廓清晰，肝竇結構正常，肝索以中央靜脈為軸心呈放射狀排列，肝細胞細胞質豐富呈紅染，無空泡。模型組大鼠肝小葉輪廓欠清晰，肝索結構紊亂，肝細胞腫脹，胞內可見大小不等的空泡。各藥物干預組大鼠肝組織病理改變較模型組有不同程度的改善，以疏肝組大鼠肝組織結構與正常組最為相似。見圖2。

圖 2 各組大鼠肝組織病理變化 （HE染色 ×200）Fig.2 H istopathological changes of liver tissues w ith HE staining in each group（ ×200）

3.3 各組大鼠血脂比較 與正常組比較， 模型組大鼠血清 TC、TG、LDL-C水平顯著升高 （P＜0.01）， HDL-C水平顯著降低 （P＜0.01）；與模型組比較， 各藥物干預組大鼠血清 TC、 LDL-C水平顯著降低 （P＜0.05， P＜0.01）， 疏肝組大鼠血清TG水平顯著降低 （P＜0.01），HDL-C水平顯著升高 （P＜0.01）；各藥物干預組間比較， 疏肝組大鼠血清 HDL-C水 平 明 顯 高 于 健 脾 組 及 合 方 組（P＜0.01）， LDL-C水平明顯低于健脾組及合方組（P＜0.05， P＜0.01）。 見表 2。

表2 各組大鼠血脂比較 （）Tab.2 Com parison of serum lipid in each group（）

表2 各組大鼠血脂比較 （）Tab.2 Com parison of serum lipid in each group（）

注： 與正常組比較，▲▲P＜0.01； 與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01； 與健脾組比較，■P＜0.05，■■P＜0.01； 與合方組比較，●●P＜0.01

組 別 動 物數 /只 TC/（ mmol·L-1） TG/（ mmol·L-1） HDL-C/（ mmol·L-1） LDL-C/（ mmol·L-1）正常組8 1.29 ±0.23 0.32 ±0.02 1.31 ±0.12 0.35 ±0.11模型組 8 3.84 ±1.06▲▲ 0.43 ±0.05▲▲ 0.85 ±0.11▲▲ 2.98 ±0.81▲▲疏肝組 9 2.26 ±0.60★ 0.30 ±0.06★★ 1.31 ±0.21★★■■●● 1.55 ±0.37★■●●健脾組 8 1.55 ±0.39★★ 0.36 ±0.09 1.01 ±0.15 0.91 ±0.40★★合方組 8 1.56 ±0.71★★ 0.35 ±0.06 0.96 ±0.21 0.93 ±0.21★★

3.4 Kupffer細胞分離及鑒定

3.4.1 細胞活性及產量 實驗結果表明， 采用離體灌注Ⅳ型膠原酶、差速離心、密度梯度離心及選擇性貼壁法成功分離大鼠 Kupffer細胞，其中每只大鼠肝臟可分離 Kupffer細胞 2.0 ×107～3.0 ×107個。 Typan blue染色鑒定兩 細胞活 性均在 95% 以上。 見圖 3， 圖 4。

圖 3 Kup ffer細胞分離Fig.3 Separation of Kup ffer cells

圖 4 貼壁培養 3 h純化后的 Kup ffer細胞 （ ×100）Fig.4 Kupffer cellswere purified by adherent culture for 3 h

3.4.2 FCM鑒定 Kupffer細胞純度 M1 為低濃度標記峰標志， M1平行線起點左側表示陰性細胞，起點右側移位峰表示陽性細胞，起點左側的高峰為IgG陰性對照峰。 Lysozyme抗體檢測 Kupffer細胞，共檢測細胞 1 ×104個， 其中表達 Lysozyme的細胞數是 9 121 個， 比例為 91.21%， 即 Kupffer細胞純度為91.21%。 見圖 5。

圖 5 FCM 鑒定 Kup ffer細胞純度Fig.5 The purity of Kupffer cellswas identificated by FCM

3.5 Kupffer細胞 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA表達與正常組比較， 模型組 大鼠 Kupffer細胞 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA表達水平顯著升高 （P＜0.01）；與模型 組 比 較， 各藥物干 預 組 大鼠 Kupffer細 胞SREBP-1c mRNA表達水平顯著降低 （ P＜0.01，P＜0.05）；各藥物干預組組間比較，疏肝組大鼠Kupffer細胞 SREBP-1c mRNA表達水平明顯低于合方組 （P＜0.05）， SCD-1 mRNA表達水平明顯低于健脾組 （P＜0.05）。提示 NAFLD大鼠 Kupffer細胞 SREBP-1c通路相關基因呈高表達，疏肝健脾方藥可顯著降低 NAFLD大鼠 Kupffer細胞 SREBP-1c通路相關基因表達水平，以疏肝組作用最為顯著。見表3， 表4。

表 3 Kup ffer細 胞 SREBP-1cm RNA表 達 水平 （， n=6）Tab.3 Exp ression levels of SREBP-1cmRNA in Kupffer cells（， n=6）

表 3 Kup ffer細 胞 SREBP-1cm RNA表 達 水平 （， n=6）Tab.3 Exp ression levels of SREBP-1cmRNA in Kupffer cells（， n=6）

注： 與正常組比較，▲▲P＜0.01； 與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01； 與合方組比較，●P＜0.05①標 準差 計算公 式為 ： S= （）1/2， 如 0.86= （ 0.692+0.542 ）1/2， 下 同。②標準差計算公式為： 2-ΔΔCT+s和 2-ΔΔCT-s， S 為 ΔΔCT的標準偏差， 如 2-（0+0.86）=0.55

2-ΔΔCT SREBP-1c正常組 27.17 ±0.69 25.40 ±0.54 1.77 ±0.86① 0 ±0.86 1（0.55-1.82）組別 SREBP-1c Average.CT GAPDH Average.CT ΔCT SREBP-1c-GAPDH ΔΔCT ΔCT-ΔCT，Blank②模型組 24.51 ±0.57 25.67 ±0.59 -1.16 ±0.82 -2.93 ±0.82 7.62（4.32-13.45） ▲▲疏肝組 26.82 ±0.35 25.44 ±0.61 1.37 ±0.70 -0.40 ±0.70 1.32（0.81-2.14） ★★●健脾組 25.62 ±0.84 25.56 ±0.41 0.06 ±0.93 -1.71 ±0.93 3.27（1.72-6.23） ★合方組 25.08 ±0.52 25.47 ±0.26 -0.39 ±0.58 -2.16 ±0.58 4.47（2.99-6.68） ★

3.6 Kupffer細胞 SREBP-1c、 SCD-1 蛋白表達 與正常組比較， 模型組大鼠 Kupffer細胞 SREBP-1c、SCD-1 蛋白表達水平顯著升高 （P＜0.01）； 與模型組比較，各藥物干預組大鼠 Kupffer細胞 SREBP-1c、 SCD-1 蛋 白 表 達 顯 著 降 低 P＜0.01， P＜0.05）。 各用藥組組間比較無統計學意義 （P＞0.05）。 見表 5， 圖 6。

表 4 Kupffer細胞 SCD-1mRNA表達水平 （， n=6）Tab.4 Expression levels of SCD-1 m RNA in Kup ffer cells（， n=6）

表 4 Kupffer細胞 SCD-1mRNA表達水平 （， n=6）Tab.4 Expression levels of SCD-1 m RNA in Kup ffer cells（， n=6）

注： 與正常組比較，▲▲P＜0.01； 與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01； 與健脾組比較，■P＜0.05①標 準差 計算公 式為 ： S= （）1/2， 如 1.07= （ 0.922+0.542 ）1/2， 下 同。②標準差計算公式為： 2-ΔΔCT+s和 2-ΔΔCT-s， S 為 ΔΔCT的標準偏差， 如 2-（0+1.07）=0.48

2-ΔΔCT SCD-1 Rel.to control正常組 31.26 ±0.92 25.40 ±0.54 5.86 ±1.07① 0 ±1.07 1（0.48-2.10）組別 SCD-1 Average.CT GAPDH Average.CT ΔCT SCD-1-GAPDH ΔΔCT ΔCT-ΔCT，Blank②模型組 28.94 ±1.32 25.67 ±0.59 3.27 ±1.45 -2.59 ±1.45 6.02（2.20-16.45） ▲▲疏肝組 30.63 ±0.75 25.44 ±0.61 5.19 ±0.97 -0.67 ±0.97 1.59（0.81-3.12） ★★■健脾組 29.18 ±0.61 25.56 ±0.41 3.62 ±0.73 -2.24 ±0.73 4.72（2.85-7.84）合方組 29.76 ±0.86 25.47 ±0.26 4.29 ±0.90 -1.57 ±0.90 2.97（1.59-5.54） ★

表 5 Kup ffer細 胞 SREBP-1c信號通 路 相 關 蛋 白 表 達 水 平（， n=6）Tab.5 Expression levels of proteins involved in SREBP-1c signal pathway in Kup ffer cells（， n=6）

表 5 Kup ffer細 胞 SREBP-1c信號通 路 相 關 蛋 白 表 達 水 平（， n=6）Tab.5 Expression levels of proteins involved in SREBP-1c signal pathway in Kup ffer cells（， n=6）

注： 與正常組比較，*P＜0.01； 與模型組比較，▲P＜0.01，▲▲P＜0.05

組 別 （ SREBP-1c/GAPDH） （ SCD-1/GAPDH）正常組0.41 ±0.12 0.73 ±0.18模型組 0.89 ±0.08* 2.04 ±0.11*疏肝組 0.66 ±0.07▲ 0.87 ±0.09▲健脾組 0.69 ±0.03▲ 1.44 ±0.22▲▲合方組 0.67 ±0.06▲ 0.80 ±0.06▲

圖 6 Kup ffer細胞 SREBP-1c、 SCD-1 蛋白灰度值比較Fig.6 Gray value of SREBP-1c and SCD-1 proteins in Kupffer cells

4 討論

祖國醫學無 “非酒精性脂肪肝” 病名，根據NAFLD的臨床表現， 大多把其歸屬于癥瘕、 積聚、脅痛、痰證、瘀證等病證范疇。中醫學認為本病的發生多因嗜食肥甘厚味，過度肥胖，或恣飲酒漿，或情志失調，或感受濕熱疫毒，或久病年老體虛等引起，與肝、脾、腎三臟功能失調密切相關。現代醫學對其發病機制的研究仍停留在假說層面，目前比較為人們所接受的假說是 1998 年 Day等［12］提出的 “二次打擊學說”。 “初次打擊” 主要是胰島素抵抗和脂質代謝紊亂所致的肝細胞脂肪變性，引起肝臟脂質貯積，形成單純性脂肪肝； “二次打擊”主要為氧化應激、脂質過氧化、炎癥性細胞因子釋放等因素引起了脂肪性肝炎，進而發生炎癥—壞死的惡性循環，最終形成脂肪性肝纖維化或肝硬化等嚴重的病理變化。

固醇調節元件結合蛋白 （ sterol regulatory element binding proteins， SREBPs） 屬于螺旋-環-螺旋-亮氨酸鋅指轉錄因子家族，在脂肪酸、甘油三酯及膽固醇合成代謝中具有中心調控地位［13］。 SREBP-1c是目前在哺乳動物體內發現的 SREBPs的 3 個亞型之一，在體內大多數組織中均有表達，以肝臟中表達較為豐富，主要負責調節脂肪酸和甘油三酯的代謝［14］。 在 NAFLD發生發展過程中， 通過調控轉錄因子 SREBPs， 進而調節肝臟脂質和葡萄糖平衡可能是 NAFLD的治療關鍵［15］，抑制 SREBP-1c可以逆轉肝臟脂肪變性［16］。SCD-1 是一類催化飽和脂肪酸形成單不飽和脂肪酸的內質網跨膜蛋白亞型之一，與酶系催化飽和脂肪酸生成的棕櫚油酰輔酶A和油酰輔酶A是體內各種脂質合成的底物，包括 TG、 膽固醇酯、 磷脂等。SCD-1 作為調節脂肪酸代謝的重要限速酶［17］， 在脂肪酸合成代謝中起著重要的調節作用［18］。 研究 表明［19-20］， NAFLD患者普遍存在肝臟 SCD-1 的激活， 肝臟脂肪百分比與 SCD-1 的激活呈正相關， 血清脂肪酸的水平亦高度 依 賴 于 SCD-1 的 激 活。 此 外 SCD-1 作 為SREBP-1c調控的下 游基因， 當 SREBP-1c轉錄因子與 SCD-1 的啟動子結合后， 可上調 SCD-1 基因轉錄，最終導致脂質合成增加，肝臟內脂質蓄積，促進 NAFLD的發展［4，21］。 Kupffer細胞， 又稱肝巨噬細胞， 約占體內巨噬細胞的 80% ～90%， 是肝臟防御系統主要成員，其最主要的生理功能是迅速吞噬和清除對人體有害的外源性顆粒及免疫活性物質。 Kupffer細胞與肝臟膽固醇和 TG的關系密切。NAFLD時， Kupffer細胞不僅影響著肝實質細胞脂質代謝的進行， 而且 Kupffer細胞本身也存在著脂質代謝障礙［22-23］。 Roth 等［23］給 予 SD大 鼠 高 脂 肪喂養后在電鏡下觀察到 Kupffer細胞內含有大量脂肪空泡。研究表明，當巨噬細胞脂肪酸增加，其中SCD的表達量會顯著增加，抑制 SCD表達后， 巨噬細胞中脂肪酸水平下降［24］， 而抑制肝臟 Kupffer細胞 活 性 可 減 弱 SREBP-1c的 激 活 及 其靶 基 因SCD-1蛋 白 表達 水 平， 導 致 肝 臟 脂 質 沉 積 形 成NAFLD［25］。 可 見 肝 臟 Kupffer細 胞 在 SREBP-1c/ SCD-1 信號通路激活引起脂質沉積過程中起著重要的作用。 目前對于 SREBP-1c/SCD-1 等脂質代謝相關信號通路的研究多著重于肝臟實質細胞中，對Kupffer細胞在該脂質代謝通路中的作用機制研究相對較少。 鑒于此， 本實 驗從 Kupffer細胞入手，以 SREBP-1c/SCD-1 信號通路為切入點， 深入開展對 NAFLD脂質代謝紊亂機制及其防治研究。

本實驗中血脂以及病理學觀察結果表明，高脂飼料喂養 8 周建立大鼠 NAFLD模型存在明顯的脂質代 謝 紊 亂， 可 能 與 模 型 組 大 鼠 Kupffer細 胞SREBP-1c、 SCD-1 mRNA及蛋白高度表達有關。 各藥物干預組 Kupffer細胞 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA及蛋白表達水平均有不同程度的下調，同時血脂及病理組織學改變也較模型組有不同程度地改善，證實疏肝健脾方藥可能是通過抑制 NAFLD大鼠Kupffer細胞 SREBP-1c信號通路激活， 使 TC、TG合成減少， 發揮抗 NAFLD的藥理作用。 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA及蛋白可能是疏肝健脾方藥抗NAFLD的有效作用靶點。

本課題組 前 期 研 究 表 明［6-7，26-28］， 肝 郁 脾 虛 的病機貫穿于 NAFLD發病過程的始終， 確立以疏肝健脾法作為 NAFLD的基本治法。 肝郁脾虛證也是2010 年 12 月中華中醫藥學會脾胃病分會在制定的《非酒精性脂肪性肝病中醫診療共識意見》［29］中提出的 NAFLD的四個基本證候之一。 從中醫學證候學來看， 隨著病程的進展， NAFLD可能或側重于肝郁、或脾虛、或肝郁脾虛并重等病機的特點。因此本實驗采用疏肝方、健脾方、合方分別干預高脂飲食誘導的 NAFLD大鼠， 旨在從中醫病機角度揭示 8 周高脂飲食誘導的 NAFLD大鼠可能存在的病機特點。在本實驗中觀察到疏肝方藥在改善血脂及病理組織學改變，下調 Kupffer細胞 SREBP-1c和SCD-1 mRNA水平明顯優于健脾方和合方。 根據以方測證法，推測肝郁脾虛且以偏重肝郁可能是此階段 NAFLD的中醫基本病機之一。 隨著 NAFLD的進一步發展，其病機又會發生怎樣的變化，值得進一步研究。 此外， 疏肝健脾方藥防治 NAFLD可能是多途徑，多靶點，多環節不同藥理作用的結果，詳細機制仍有必要繼續作進一步的探討。

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Effects of soothing liver and invigorating sp leen recipes on SREBP-1c signal pathway related genes and proteins in Kup ffer cells of nonalcoholic fatty liver disease rats

HAN Li1， YANG Qin-he2*， ZHANG Yu-pei2， XU Yong-jian2， LIU Yi-zhen2， YANG Xue-song3，JIN Ling1
（1.The First Affiliated Hospitalof Jinan University， Guangzhou 510632， China； 2.Departmentof Traditional ChineseMedicine， Medical Collegeof Jinan University， Guangzhou 510632， China； 3.Department of Histology and Embryology， Medical College of Jinan University， Guangzhou 510632， China）

AIM To explore effects of soothing liver and invigorating spleen recipes on sterol regulatory element binding proteins-1c（SREBP-1c） signal pathway related genes and proteins in Kupffer cells of nonalcoholic fatty liver disease（ NAFLD） rats， and to study its possible preventive mechanism.METHODS The rats of NAFLDmodelwere induced by feeding a high-fat diet.The treatmentgroupswere given a gavage of soothing liver and invigorating spleen recipes.After treatment for 8 weeks， detecting routine blood biochemical indicator and liver tissue pathological changes， collagenase（TypeⅣ） was perfused to digest liver tissue with the circulation in vitro to separate Kupffer cells.Real-time Q-PCR and Western blotwere used to detect the expression levels of SREBP-1csignal pathway related genes and proteins.RESULTS The model group rats appeared hepatic fat accumulation obviously.Blood lipid and the expression levels of SREBP-1c， stearyl-CoA desaturase-1 （ SCD-1 ） genes and proteins in model group were higher than those in normal group.Compared with themodel group， SREBP-1c， SCD-1 genes and proteins decreased in all drug therapy groups.Levels of blood lipid and pathological changes showed different improvements， and the effect of soothing liver recipes was remarkable（ P＜0.01 ） .CONCLUSIONS Soothing liver and invigorating spleen recipes have good effect on NAFLD， which may be due to inhibiting the activation of SREBP-1c/SCD-1 in Kupffer cells， downing serum total cholesterol， triglyceride synthesis，reducing hepatic lipid deposition.SREBP-1c， SCD-1mRNA and proteinmay be effective targets for soothing liver and invigorating spleen recipes to treat NAFLD.

soothing liver and invigorating spleen recipes； nonalcoholic fatty liver disease； sterol regulatory element binding proteins-1c；stearyl-CoA desaturase-1； Kupffer cells； rats

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）05-0885-08

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.001

2013-06-12

國家自然科學基金資助項目 （81173216）

韓 莉 （1963—）， 女， 醫學碩士， 副主任醫師， 主要從事中醫藥治療代謝異常疾病及脂肪肝的臨床療效觀察及研究工作。Tel： 13826120177， E-mail： hanli168@aliyun.com

*通信作者： 楊欽河 （1961—）， 男， 醫學博士， 教授， 博士生導師， 從事中西醫結合防治慢性肝病及脂質代謝疾病研究工作。 Tel：（020） 85226197 ， E-mail： tyangqh@jnu.edu.cn