白藜蘆醇預處理對缺糖缺氧再灌注大鼠原代皮質神經元的保護作用

張黎黎， 黃家貴， 沈長波， 劉 舒， 徐 蘭， 楊 琴

（重慶醫科大學附屬第一醫院神經內科，重慶 400016）

白藜蘆醇預處理對缺糖缺氧再灌注大鼠原代皮質神經元的保護作用

張黎黎， 黃家貴， 沈長波， 劉 舒， 徐 蘭， 楊 琴*

（重慶醫科大學附屬第一醫院神經內科，重慶 400016）

目的 探討白藜蘆醇預處理對缺糖缺氧再灌注所致大鼠原代皮質神經元損傷的保護作用及機制。方法40 μmol/L白藜蘆醇預處理大鼠原代皮質神經元 24 h， 皮質神經元缺糖缺氧 150 min， 恢復正常培養 24 h， 構建缺糖缺氧再灌注損傷。實驗分為正常組，模型組，白藜蘆醇組。倒置顯微鏡下觀察細胞形態。免疫熒光染色鑒定神經元。MTT法檢測細胞活力。 化學比色法測定培養上清液 LDH活性和細胞內 SOD活性。 TUNEL檢測細胞凋亡。 免疫印跡法和免疫熒光法檢測 Bcl-2、 Caspase-3、 Nrf-2、 NQO-1 蛋白表達。 結果 細胞培養 6 d， 免疫熒光染色顯示 90% 的細胞是神經元特異性烯醇化酶陽性。與模型組相比，白藜蘆醇預處理能明顯降低培養上清液乳酸脫氫酶活性，增強細胞內SOD活性和神經元細胞活力， 減少細胞凋亡， 上調 Bcl-2、 Nrf-2 和 NQO-1 蛋白表達， 下調 Caspase-3 蛋白表達； 促進Nrf-2 蛋白從細胞漿轉移到細胞核。 結論 白藜蘆醇對大鼠原代皮質神經 元缺糖缺氧 再灌注 損傷有良好 的保護作用，其機制可能是通過抗凋亡和抗氧化途徑實現。

白藜蘆醇；預處理；神經元；再灌注損傷

缺血性腦卒中一旦發生，雖經多種藥物或方法治療，致死致殘率仍極高，并且復發機率也高，因此預防缺血性腦血管疾病的發生具有重要意義。白藜蘆醇 （resveratrol） 是一種含有芪類結構的非黃酮類多酚化合物，主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖、花生等植物中，具有抗腫瘤、抗炎、抗血小板聚集、 清除自由 基、 抗 氧化等多種藥理活性［1-3］。 法國飲食能顯著降減心腦血管疾病的發生率，與長期攝入富含白藜蘆醇的葡萄酒有關。課題組前期的體內試驗已證明白藜蘆醇預處理能減輕腦缺血再灌注導致的腦損害［4］，但在體外是否也能減輕缺糖缺氧再灌注對神經元的損傷，證據尚不充分，其機制亦未明確。本實驗在體外采用大鼠原代皮質神經元缺糖缺氧再灌注損傷 （ oxygen and glucose deprivation/reperfusion， OGD/Rep） 模 型， 進 一 步 探 討 白藜蘆醇預處理對缺糖缺氧再灌注損傷大鼠原代皮質神經元的保護作用及可能的機制，為白藜蘆醇預防缺血性腦血管疾病的發生提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康新生 24 h 內 SD大鼠， 雌雄不限，由成都醫學院第一附屬醫院實驗中心提供。 動物合格證號： 20120305。

1.1.2 主要試劑 白藜蘆醇 （純度 99%） 購自陜西慈緣生物有限公司， D-Hanks液、 DMEM/F12 培養基 購 自 Hyclone公 司，L-谷 氨 酰 胺、 Neurobasal medium、MTT、 B27購 自 Gibco 公 司， 一 步 法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒、 細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒購自碧云天生物技術研究所。超氧化物歧化酶 （SOD）、 乳酸脫氫酶 （LDH） 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。兔抗大鼠核因子E2-相 關 因 子 2 （ nuclear factor erythroid-2-related factor 2， Nrf-2 ）、 山 羊 抗 大 鼠 苯 醌 氧 化 還 原 酶［ NAD（ P） H quinone oxidoreductase-1， NQO-1 ］ 多克隆抗體購自 Abcam公司， 兔抗大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 （caspase-3） 和 Bcl-2 多克隆抗體購自 Santa Cruz公司， 兔抗大鼠 β-actin、 兔抗大鼠神經元特異性烯醇化酶 （NSE） 多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司， HRP標記的羊抗兔 IgG和 FITC標記的羊抗兔 IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器 隔水式電熱恒溫培養箱 （上海市躍進醫療器械廠）； 倒置相差顯微鏡 （ Olympus Japan）； 自動酶標儀 （奧地利 Tecan 公司）； 凝膠成像儀 （美國 Bio-Red）； TCSSP2 激光共聚焦顯微鏡 （德國 Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠原代皮質神經元的培養 參照 Chen 等建立的方法［5］， 75% 乙醇浸泡 SD大鼠，無菌條件下迅速分離大腦皮質并放置于 DMEM/F12 培養液中，小鑷子剝離大腦皮質表面的腦膜和血管，去除海馬部分，將其剪碎并置于培養皿中， 用 0.125%胰蛋白酶在 37 ℃、 5%CO2培養箱中消化 30 min（每隔 10 min 搖 晃 培 養 皿 數 次 以 充 分 消 化），DMEM/F12 培養基 （含 10% 胎牛血清） 終止消化， 先后用 400 目及 200 目的篩子過濾懸液， 離心取沉積物收集細胞，臺盼藍拒染法計數活細胞。將細胞接種于預先用多聚賴氨酸處理的孔板中 （添加 10% 胎牛血清和 DMEM/F12 培養基）， 置于37 ℃、 5%CO2培養箱中培養。 細胞培養 6 h 貼壁后， 更 換 培 養 液 為 Neurobasal medium （ 2%B27、100 U/m L青霉素 /0.1 mg/mL鏈霉素、 0.5 mmol/L L-谷氨酰胺）， 每兩天換液 1 次。 培養至 6 d 的細胞用于實驗。

1.2.2 神經元鑒定及純度檢測 皮質神經元培養6 d 后， 棄培養液， PBS 洗滌 3 次，加入 4%多聚甲醛室溫固定 15 min 后， NSE多克隆抗體免疫熒光染色鑒定神經元。 在400 倍鏡下分別計數 3 個孔各5個視野的陽性細胞數和總細胞數，計算陽性細胞的百分比，以此代表神經元純度。

1.2.3 實驗分組 將大鼠原代皮質神經元分為 3組。即正常組：按照原代皮質神經元培養方法培養。模型組：進行缺糖缺氧再灌注損傷處理。白藜蘆醇組： 用含 40 μmol/L白藜蘆醇的完全培養基對大鼠原代皮質神經元預處理24 h， 再進行缺糖缺氧再灌注損傷處理。

1.2.4 皮質神經元缺糖缺氧再灌注損傷 （OGD/ Rep） 模型的構建 參照 Chen 等［5］建立的方法，除去完全培養基， 以 D-Hanks液清洗 3 次后每孔加入 D-Hanks液 2 mL， 置 于 細 胞 缺 氧 培 養 箱，37 ℃、 通入 95%N2和 5%CO2培養 150 min。 缺糖缺氧后， 將 D-Hanks液更換為 Neurobasalmedium（含 2%B27） 并置于 37 ℃、 5%CO2培養箱中繼續培養24 h， 模擬再灌注損傷。

1.2.5 MTT法測定細胞活力 細胞孵育終止前每孔加入 5 g/L的 MTT 20 μL， 37 ℃、 5%CO2培養箱中繼續孵育4 h， 用無菌槍頭小心吸棄培養液，然后每孔加入 200 μL二甲基亞砜 （DMSO）， 避光震蕩 10 min，使 用空白 對照孔 調零， 酶標儀 測490 nm處吸光度。 重復實驗3 次，每次各組設5 個復孔。

1.2.6 SOD和 LDH活性的測定 正常組以及對模型組、白藜蘆醇組神經元缺糖缺氧再灌注損傷后取各組培養上清液以及提取細胞蛋白，采用化學比色法測定 SOD和 LDH活性， 按照試劑盒使用說明操作。重復實驗3次，每次各組設3個復孔。

1.2.7 TUNEL染色 用多聚賴氨酸預處理細胞爬片， 接種原代皮質神經元前用 PBS 清洗爬片 3 次，上述方法培養原代皮質神經元6 d。 經缺糖缺氧再灌注損傷后， 各組用 PBS 洗滌 3 次； 4% 多聚甲醛室溫下固定 10 min， PBS 洗滌 3 次； 加入熒光素37 ℃避光孵育 1 h， PBS 洗滌 3 次，DAPI染核2 min， PBS 洗滌 3 次， 50% 甘油封片， 熒光顯微鏡檢查拍照。重復實驗3次。

1.2.8 免疫細胞化學染色 用注射器小心吸棄培養液， PBS 清洗細胞 3 次， 先后用 4%多聚甲醛固定細 胞 15 min， 0.3%Triton X-100 破 膜 5 min，10% 山羊血清封閉 30 min， 甩去多余血清； 各組加入兔抗大鼠 Nrf-2 （1 ∶500 稀釋） 或兔 抗大鼠NSE（1 ∶100 稀釋） 多抗， 4 ℃過夜，正常組用PBS 液代替一抗； PBS 清洗 3 次， 加入 FITC標記的羊抗兔 IgG （1 ∶50 稀釋）， 室溫避光孵育 1 h，PBS 清洗 3 次， 用 PI染核 2 min， PBS 清洗 3 次，吸干殘余的液體后用 50% 甘油封片， 熒光顯微鏡觀察拍照。重復實驗3次。

1.2.9 Western blot法 收取細胞， 按照蛋白抽提試劑盒說明 書 提 取蛋白。 Bradford 法檢測 蛋 白 濃度。 將每組蛋白用 5 ×loading buffer稀釋成相同濃度， 100 ℃水浴10 min， -80 ℃保存。 按照每個樣本蛋白加樣量 30 ～40 μg用 SDS-PAGE分離后電轉移至 PVDF膜上。 取出膜用脫脂奶粉封閉 1 h， 置于雜交袋中， 分別加入 兔 抗 大 鼠 Caspase-3 多 抗（1 ∶200 稀釋）、 兔抗大鼠 Bcl-2 多抗 （1 ∶200 稀釋）、 兔抗大鼠 Nrf-2 多抗 （1 ∶1 000 稀釋）、 山羊抗大鼠 NQO-1 多抗 （1 ∶1 000 稀釋）， 4 ℃孵育過夜。 TBST漂洗3 次，加入 HRP標記的山羊抗兔或驢抗山羊 IgG （1 ∶1 000 稀釋）， 37 ℃ 孵育 1 h，TBST漂洗 3 次。 PVDF膜上覆蓋足量 ECL發光試劑顯色并照相。 用 Quantity One 4.6.2 圖像分析軟件對圖像進行分析， 以目的條帶與 β-actin 光密度的比值作為蛋白表達相對水平。重復實驗3次。

1.3 統計學處 理 應用 SPSS 17.0 軟 件對實驗結果進行統計學分析， 實驗數據以均數 ±標準差（） 表示， 多組數據參數間比較采用單因素方差分析， 組內兩兩比較采用 SNK-q 檢驗， 以 P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠原代皮質神經元生長及鑒定 在倒置相差顯微鏡下觀察， 接種前6 h， 細胞體積較小， 呈圓形；6 h后，細胞完全貼壁，并開始長出小突起。完全培養基培養3～4 d后，細胞體增大， 呈橢圓形或三角形，細胞突起呈稀疏網狀連接，呈雙極或多極。 培養至6 d， 胞體及突起立體感和折光性強， 此時免疫熒光染色顯示 90% 的細胞為 NSE陽性，表明神經元的純度能滿足下一步的研究（見圖1）。

圖 1 大鼠原代皮質神經元形態學 （ ×200） 與鑒定 （FITC PI×400）Fig.1 Rat prim ary cortical neuronsm orphology （ ×200） and identification（ FITC PI×400）

2.2 白藜蘆醇對神經元 OGD/Rep 后細胞活力的影響 經過缺糖缺氧再灌注損傷后， MTT法檢測結果顯示， 模型組 （37.7% ±4.5%） 和白藜蘆醇組（56.4% ±5.4%） 細胞活力較正常組明顯降低（P＜0.01）。 但白藜蘆醇組細胞活力較模型組明顯增高 （P＜0.01） （見圖 2）。

2.3 白藜蘆醇對神經元 OGD/Rep 后 SOD和 LDH活性的影響 與正常組相比，經過缺糖缺氧再灌注損傷后， 模型組 SOD活性降低 （P＜0.05）， 白藜蘆醇組SOD活性較正常組和模型組明顯升高 （P＜0.05）； 與正常組相比， 模型組培養上清液 LDH活性顯著升高（P＜0.05）， 白藜蘆醇組培養上清液 LDH活性較正常組升高、 較模型組明顯降低 （P＜0.05） （見圖3）。

圖 2 白藜蘆醇對神經元 OGD/Rep后細胞活力的影響Fig.2 E ffect of resveratrol on cell viability of neu rons after OGD/Rep

圖 3 白藜蘆醇對神經元 OGD/Rep后 SOD和 LDH活性的影響Fig.3 Effect of resveratrol on SOD and LDH activity of neurons after OGD/Rep

2.4 白藜蘆醇對神經元 OGD/Rep 后細胞凋亡以及凋亡相關蛋白表達的影響 正常組有少量神經元細胞凋亡，經過缺糖缺氧再灌注損傷后，模型組神經元細胞凋亡明顯，白藜蘆醇組神經元細胞凋亡高于正常組但少于模型組 （ P＜0.01）。 Western blot法分析顯示白藜蘆醇能明顯降低促凋亡蛋白 Caspase-3 的表達 （P＜0.01）， 升高抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表達 （P＜0.01）（見圖4 ～5）。

圖 4 白藜蘆醇對神經元 OGD/Rep后細胞凋亡的影響 （TUNEL staining ×200）Fig.4 Effect of resveratrol on apoptosis of neurons after OGD/Rep（ TUNEL staining ×200）

圖 5 白藜蘆醇對神經元 OGD/Rep后凋亡相關蛋白表達水平的影響Fig.5 Effect of resveratrol on apoptosis related protein expression in neurons after OGD/Rep

2.5 白 藜 蘆 醇 對 蛋 白 Nrf-2 核 轉 移 和 Nrf-2、NQO-1 表達的影響 免疫熒光結果提示，Nrf-2 蛋白主要存在于正常培養神經元的細胞漿，缺糖缺氧再灌注損傷可促使部分 Nrf-2 蛋白進入細胞核，而白藜蘆醇預處理可 顯著促 進 Nrf-2 蛋白 的核轉移。 Western blot法分析顯示，經過缺糖缺氧再灌注損傷后， 模型組 Nrf-2 和 NQO-1 蛋白的表達較正常組升高 （P＜0.05）； 與模型組相比， 白藜蘆醇能明顯升 高 Nrf-2 和 NQO-1 蛋白的表達 （ P＜0.01）（見圖 6 ～7）。

圖 6 免疫熒光檢測白藜蘆醇對蛋白 Nrf-2 核移位的影響 （FITC PI×400）Fig.6 Effect of resveratrol on Nrf-2 nuclear translocation by immunofluorescence（ FITC PI×400）

圖 7 白藜蘆醇對神經元 OGD/Rep后蛋 白 Nr f-2 和NQO-1 表達水平的影響Fig.7 Effect of resveratrol on protein expression of Nrf-2 and NQO-1 after OGD/Rep

3 討論

白藜蘆醇是多酚類化學物，是植物生長中為對抗紫外線照射、真菌感染等不利因素產生的一種植物抗毒素，廣泛的存在于人類食物中，如葡萄、花生、鳳梨、桑葚等。白藜蘆醇進入血液后迅速與葡萄醛酸衍生物相結合，以結合的形式運輸。該形式的白藜蘆醇較易透過血腦屏障 （BBB），進入腦組織［6］，易透過細胞膜，還可穿過細胞質進入細胞核， 更好的發揮抗氧化作用［7］， 這成為白藜蘆醇能起到腦保護作用的藥理學基礎。研究表明，白藜蘆醇可以增強超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化酶的活性，提高機體清除自由基的能力［8］， 降低血管內皮細胞氧化應激損傷； 對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用［4］； 同時白藜蘆醇還具有神經誘導潛能［9］。 LDH是細胞內酶， 其漏出多少可反映細胞膜的受損程度［10］。 SOD是生物體內重要的抗氧化酶，是生物體內清除自由基的首要物質。本實驗結果發現，白藜蘆醇可增強細胞活力， 降低培養液中 LDH活性， 升高細胞內 SOD活性， 表明其可以降低 OGD/Rep 后對神經元造成的傷害。

細胞死亡包括壞死和凋亡。壞死不可逆而凋亡可逆。缺血性腦卒中后，凋亡細胞的多少決定腦梗死體積的大小，因此抗凋亡治療是減輕缺血性腦損害的策略之一。凋亡由一系列基因和蛋白酶控制。Caspase-3 參與了腦缺血后神經元損傷的病理過程，其表達的高低反映細胞凋亡的程度［11］。Bcl-2 是抗細胞凋亡基因之一，其表達的高低反映細胞抗凋亡的程度。本實驗發現，正常組神經元細胞有散在的凋亡細胞及少量 Caspase-3 和 Bcl-2 蛋 白的表達。經過缺糖缺氧再灌注損傷后，凋亡細胞數目明顯增多， Caspase-3 蛋白表達明顯增強， 而經白藜蘆醇預處理后， 凋亡細胞數目顯著減少， Caspase-3 蛋白表達顯著降低， Bcl-2 蛋白表達顯著升高， 提示白藜蘆醇預處理能抑制 Caspase-3 蛋白和促進 Bcl-2蛋白的表達，從而減輕缺糖缺氧再灌注后神經元的損傷。表明白藜蘆醇具有抗凋亡作用。

在生物體抗氧化過程中， Nrf2/ARE信號通路發揮著重要作用［12-14］。 在 生 理狀態下， Nrf-2 蛋 白位于胞漿，活性被抑制。在病理狀態或某些因素作用下， Nrf-2 蛋白移位到胞核， 與 ARE結合， 啟動一系列抗氧化酶 ［如苯醌氧化還原酶 （NQO-1）］的轉錄。 NQO-1 是廣泛分布的黃素腺堿二核苷依賴的黃素蛋白，具有很強的抗氧化功能和細胞保護作用。 本實驗結果顯示， 在正常培養條件下， Nrf-2蛋白主要表達于神經元胞漿。經缺糖缺氧再灌注損傷后， Nrf-2 蛋白部分移位到神經元胞核。 而白藜蘆醇預處理則可顯著促使 Nrf-2 蛋白移位到神經元胞核， 同時增強 Nrf-2 和 NQO-1 蛋白的表達， 表明缺血缺氧和白藜蘆醇預處理均可激活 Nrf2/ARE信號通路，從而增強抗氧化酶的表達。這與本課題組 前 期 的 體 內 研 究 和 Yang等 的 體 內 研 究一致［14-15］。

本實驗結果表明，白藜蘆醇預處理對體外培養缺糖缺氧再灌注損傷的皮質神經元有保護作用，其保護機制至少部分是通過抗凋亡和抗氧化而實現。

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Effect of resveratrol on rat primary cortical neurons during oxygen and glucose deprivation/reperfusion injury

ZHANG Li-li， HUANG Jia-gui， SHEN Chang-bo， LIU Shu， XU Lan， YANG Qin*
（Department of Neurology， The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China）

AIM To study the effectandmechanism of resveratrol on ratprimary cortical neurons during oxygen and glucose deprivation/reperfusion injury（OGD/Rep） .METHODS Rat primary cortical neurons were pretreated with 40 μmol/L resveratrol for 24 hours， then cultured with oxygen and glucose deprivation for 150 minutes and returned to normal culture for 24 hours.Cells were divided into three groups including the normal group， model group and resveratrol group.MTT assay detected cell viability.Chemical colorimetry detected SOD and LDH activity.TUNEL detected cellapoptosis.The expression levels of Bcl-2 ，Caspase-3 ，nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （ Nrf-2）， and NAD（ P） H quinone oxidoreductase-1 （ NQO-1 ） proteins were detected by Western blot.RESULTS Compared with model group， resveratrol significantly reduced LDH activity， enhanced intracellular SOD activity and neuronal cell viability， decreased the numbers of apoptosis and the expression level of Caspase-3 protein，increased the expressions of Bcl-2 ， Nrf-2 ，and NQO-1 proteins， and promoted the Nrf-2 to enter into the nuclei from the cytosol.CONCLUSION Resveratrol has a good protective effect on rat primary cortical neurons during OGD/Rep.Its protectivemechanism may be associated with antioxidation and anti-apoptosis.

resveratrol； pretreatment； neuron； reperfusion injury

R966

： A

： 1001-1528（2014）05-0897-07

98,ebook=19

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.003

2013-05-18

國家自然科學基金面上項目 （81071119） ； 重慶市衛生局科研基金 （2009-2-359）

張黎黎 （1982—） ， 女， 碩士生。 Tel： 13880039591， E-mail： hanyun.pear@163.com

*通信作者： 楊 琴 （1970—） ， 女， 教授， 研究方向： 腦血管疾病與干細胞移植。 E-mail： xyqh200@126.com