補腎益壽片對注射 D-半乳糖小鼠的抗衰老作用

劉明娟， 顏禮有， 范忠原， 郭積芳， 楊建雄*

（1.陜西師范大學， 陜西 西安 710119； 2.中國農業科學院特產研究所， 吉林 長春 130117）

補腎益壽片對注射 D-半乳糖小鼠的抗衰老作用

劉明娟1， 顏禮有1， 范忠原2， 郭積芳1， 楊建雄1*

（1.陜西師范大學， 陜西 西安 710119； 2.中國農業科學院特產研究所， 吉林 長春 130117）

目的 探討補腎益壽片對 D-半乳糖衰老模型小鼠的抗衰老作用。 方法 將 50 只小鼠隨機分為 5 組： 對照組頸背部皮下注射生理鹽水， 模型組頸背部皮下注射 D-半乳糖， 兩組都用羧甲基纖維素鈉水溶液灌胃； 低、 中、 高劑量 3個給藥組頸背部皮下注射 D-半乳糖， 及用不同劑量的補腎益壽片灌胃。 42 d 后觀察脾臟指數、 增重率， 測定血清、肝臟、 腦組織超氧化物歧化酶 （SOD）、 谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-PX）、 丙二醛 （ MDA） 水平、 總抗氧化活力 （TAOC） 及腦組織單胺氧化酶 （MAO） 活力等指標。 結果 中、 高劑量補腎益壽片能抑制 D-半乳糖致衰老模型小鼠的增重率和脾臟指數下降， 提高血清和各臟器 SOD， GSH-PX和 T-AOC活力， 降低 MDA水平和腦 MAO活力。 結論 補腎益壽片有較強的抗衰老作用。

補腎益壽片； 抗衰老； D-半乳糖衰老模型； 超氧化物歧化酶； 谷胱甘肽過氧化物酶； 丙二醛； 單胺氧化酶； 總抗氧化活力

衰老是生物在發育成熟后隨著時間的推移，而表現出的各個細胞和器官功能不可逆逐漸喪失，其機制是一個十分復雜的多環節生物學過程［1］。 自由基學說認為，隨著年齡的增長，機體的抗氧化系統失去平衡，導致自由基過剩，最終導致細胞功能嚴重受損以至衰老、 死亡［2］。 補腎益壽片是由淫羊藿、紅參、制何首烏、靈芝、珍珠、枸杞子、丹參、黃精和甘草九味中藥組成的中成藥。其主要功能為補腎益氣，能調節老年人免疫功能趨于正常，延緩機體衰老，用于失眠，耳鳴，腰酸，健忘，倦怠，胸悶氣短，夜尿頻多，性功能減退等。主要組成淫羊 藿［3-4］、 紅 參［5］和 枸 杞 子［6］等 均 具 有 抗 疲勞、抗氧化、抗衰老的功效。本實驗通過對小鼠頸背部皮下注射 D-半乳糖建立亞急性衰老模型， 探討補腎益壽片對衰老小鼠抗氧化指標和衰老相關指標的影響，期望為補腎益壽片用于防治衰老相關疾病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 健康昆明系小鼠由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供， 許可證號 SCXK（陜） 2007-001， 雌雄各半，體質量 18 ～22 g； 補腎益壽片 （規格 0.4 g/片， 批號 20060306，康普藥業股份有限公司） 用 0.5%的羧甲基纖維素鈉制成懸浮液； D-半乳糖購自南京建成生物工程研究所； 數顯恒溫水浴鍋 （國華電器有限公司）；Epoch 超 微 量 微 孔 板 分 光 光 度 計 （ 美 國 BioTek 公司）； 臺式 高 速 冷凍離心機 （ 美國 sigma公司）；DY89-II型電動玻璃勻漿機 （寧波新生生物科技股份有限公司）。

1.2 動物分組與處理 將 50 只小鼠隨機均分為 5組：對照組、模型組、補腎益壽片低、中、高劑量組， 每組10只， 雌雄各半， 用西安交通大學醫學院實驗動物中心提供的標準飼料分籠飼養，自由飲食飲水。適應性喂養2 d后進行實驗，實驗前記錄小鼠初始體質量。每天上午低、中、高劑量組分別以 0.3、 1、 3 g/kg補腎益壽片灌胃， 對照組和模型組用等體積羧甲基纖維素鈉水溶液灌胃；同時模型組和 3 個劑量組按 150 mg/kg劑量頸背部皮下注射 D-半乳糖， 對照組以等體積生理鹽水注射， 灌胃與注射同時進行， 連續 42 d。

1.3 標本采集 給藥結束后稱量小鼠體質量并記錄， 眼眶采血， 以 3 500 r/min 離心 10 min 后收集上層血清待測。頸椎脫臼處死小鼠后迅速取出大腦和肝臟，用冰冷的生理鹽水沖洗后，取部分腦組織和肝臟組織用生理鹽水分別制成 5%的勻漿，3 500 r/min離心 15 min 后取上清液待測。同時取出新鮮脾臟吸干表面水分測重，計算脾臟指數和增重率。 計算公式為： 脾臟指數 =脾臟質量 （mg） /體質量 （g）， 增重率 = （終體質量 -初始體質量） /初始體質量。

1.4 生化指標測定 血清和各組織超氧化物歧化酶 （SOD）， 谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-PX）， 單胺氧化酶 （MAO）， 總抗氧化活力 （T-AOC） 活力測定， 及MDA和蛋白水平測定均采用由南京建成生物工程研究所試劑盒提供的方法，嚴格按照試劑盒說明進行操作，用超微量微孔板分光光度計（美國 BioTek，型號： Epoch） 測定吸光度。

1.5 數據處理 數據用 SPSS 18.0 統計軟件采用 t檢驗進行分析， 以表示。

2 結果和分析

2.1 補腎益壽片對小鼠體質量、 脾臟指數變化的影響 如表1所示，模型組的增重率明顯小于對照組 （P＜0.01）， 補腎益壽片低劑量組增重率與模型組相比無差異 （P＞0.05）， 中、 高劑量組的增重率明顯高于模型組 （P＜0.01）； 模型組脾臟指數明顯小于對照組 （P＜0.05）， 低劑量組較模型組無顯著性差異 （P＞0.05）， 中、 高劑量組明顯高于模型組 （P＜0.05）。

表1 各組小鼠的增重率和脾臟指數 （， n=10）Tab.1 Weight gain rate and spleen index of all groups（， n=10）

表1 各組小鼠的增重率和脾臟指數 （， n=10）Tab.1 Weight gain rate and spleen index of all groups（， n=10）

注： 與對照組比較，△P＜0.05；△△P＜0.01； 與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。 下表同

組別 給藥劑量/（ g·kg-1）增重率/%脾臟指數/（ mg·g-1）- 30.94 ±3.41 3.75 ±0.49模型組 - 25.80 ±2.88△△ 3.31 ±0.25△補腎益壽片 0.3 25.85 ±2.47 3.70 ±0.53補腎益壽片 1 28.92 ±1.82** 3.81 ±0.55*補腎益壽片 3 28.89 ±2.25** 3.85 ±0.62對照組*

2.2 各組小鼠血清生化指標的比較 如表 2 所示， 模型組血清 SOD、 GSH-PX及 T-AOC活 力較對照組明顯降低 （P＜0.05）， MDA水平顯著增加 （P＜0.05）； 補腎益壽片中、 高劑量組血清SOD、 GSH-PX活力及 T-AOC能力較 模 型 組顯著增加 （ P＜0.05）， MDA水 平 顯 著 降 低 （ P＜0.05）； 低劑量組與模型組比較則無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 各組小鼠肝組織生化指標的比較 如表 3 所示， 模型組肝臟組織 SOD， GSH-PX以及 T-AOC活力較對照組顯著降低 （P＜0.05， P＜0.01）， MDA水平明顯增高 （P＜0.05）； 補腎益壽片中、 高劑量組肝臟組織 SOD、 GSH-PX及 T-AOC活力較模型組顯著增加 （P＜0.05）， MDA水平顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組小鼠血清的生化指標 （， n=10）Tab.2 Serum biochem ical indicators of all groups（， n=10）

表2 各組小鼠血清的生化指標 （， n=10）Tab.2 Serum biochem ical indicators of all groups（， n=10）

組 別 給 藥劑 量 /（ g·kg-1） SOD/（ U·m L-1） GSH-PX/（ U·mL-1） T-AOC/（ U·mL-1） MDA/（ nmol·mL-1）84.63 ±10.58 232.8 ±30.5 8.25 ±1.01 17.5 ±2.43模型組 - 71.38 ±11.04△ 198.9 ±30.8△ 6.63 ±1.78△ 20.78 ±2.79△補腎益壽片 0.3 76.03 ±9.80 217.9 ±26.7 7.34 ±1.04 18.7 ±2.51補腎益壽片 1 81.93 ±8.81* 229.8 ±26.3* 8.07 ±0.86* 17.71 ±2.32*補腎益壽片 3 83.39 ±9.12* 234.5 ±26.7* 8.09 ±0.77* 17.63 ±2.24對照組-*

表3 各組小鼠肝組織的生化指標 （， n=10）Tab.3 Liver biochem ical indicators of all groups（， n=10）

表3 各組小鼠肝組織的生化指標 （， n=10）Tab.3 Liver biochem ical indicators of all groups（， n=10）

組 別 給 藥劑 量 /（ g·kg-1） SOD/（ U·mgprot-1） GSH-PX/（ U·mgprot-1） T-AOC/（ U·mgprot-1） MDA/（ nmol·mgprot-1）對照組 —193.8 ±17.3 719.7 ±79.2 1.41 ±0.13 1.55 ±0.13模型組 — 174.1 ±19.9△ 625.1 ±78.7△ 1.21 ±0.14△△ 1.77 ±0.20△補腎益壽片 0.3 178.5 ±18.6 665.9 ±71.2 1.31 ±0.17 1.63 ±0.15補腎益壽片 1 192.4 ±16.7* 695.3 ±59.5* 1.35 ±0.14* 1.59 ±0.12*補腎益壽片 3 194.2 ±20.3* 691.9 ±48.1* 1.36 ±0.11* 1.58 ±0.13*

2.4 各組小鼠腦組織生化指標的比較 如表 4 所示， 與對照組相比， 模型組 MDA水平及 MAO活力顯著升高 （P＜0.05）， SOD及 T-AOC活力顯著降低 （P＜0.05， P＜0.01）； 低劑量組較模型組無明顯差異 （P＞0.05）； 中、 高劑量組 MDA水平、MAO活力較模型組明顯降低 （P＜0.05， P＜0.01）， SOD及 T-AOC活力顯著增強 （P＜0.05）。

表4 各組小鼠腦組織的生化指標 （， n=10）Tab.4 Brain biochem ical ind icators of all groups（， n=10）

表4 各組小鼠腦組織的生化指標 （， n=10）Tab.4 Brain biochem ical ind icators of all groups（， n=10）

組 別 給 藥劑 量 /（ g·kg-1） MDA/（ nmol·mgprot-1） MAO-B/（ U·mgprot-1） SOD/（ U·mgprot-1） T-AOC/（ U·mgprot-1）對照組 —2.54 ±0.13 12.95 ±2.26 93.22 ±12.51 1.40 ±0.12模型組 — 2.77 ±0.21△ 15.64 ±2.28△ 80.19 ±13.83△ 1.21 ±0.14△△補腎益壽片 0.3 2.63 ±0.16 13.67 ±2.03 85.56 ±13.64 1.31 ±0.16補腎益壽片 1 2.57 ±0.14* 13.39 ±1.95* 91.80 ±9.42* 1.36 ±0.15*補腎益壽片 3 2.57 ±0.12* 12.80 ±1.82** 93.66 ±10.04* 1.37 ±0.12*

3 討論

隨著年齡的增長，由于體內的抗氧化酶活力急劇下降，因此無法及時清除體內產生的自由基，過剩的自由基使膜結構中的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，生成的脂質過氧化物及其分解產物使核酸及蛋白質分子發生交聯聚合，進一步造成基因突變或 DNA復制異常， 酶活力下降， 最終導致細胞功能嚴重受損 以至衰 老、 死亡［7-8］， 同時機 體的免疫系統也遭到破壞，這也是加速衰老的原因之一［9］。因此， 尋求清除體內自由基以及脂質過氧化產物的藥物尤為重要。

3.1 補腎益壽片對小鼠體質量、 脾臟指數變化的影響 有研究表明，衰老后機體的質量以及免疫功能呈下 降趨 勢［10-11］， 本 實 驗結 果 表 明， 與 模 型 組相比較，補腎益壽片的中、高劑量組的小鼠體質量和脾臟質量均有顯著增加，提示一定劑量補腎益壽片可以防止小鼠衰老過程中體質量的減輕和免疫功能的降低。這可能與補腎益壽片中多種成分可增強機體免疫 功 能， 從 而 延 緩 衰 老 有 關［12-13］。 中、 高劑量組小鼠增重率和脾臟指數的數據相比較無顯著性差異，說明中劑量已經達到有效防止衰老小鼠體質量降低和脾臟指數減小的合適劑量。

3.2 補腎益壽片對各組小鼠血清生化指標的影響本結果表明， 中、 高劑量組的 SOD、 GSH-PX、T-AOC活力較模型組有顯著性增強， MDA水平顯著降低，提示一定劑量的補腎益壽片可以清除機體自由基，降低脂質過氧化物的生成，從而增強抗氧化能力，這可能與補腎益壽片中多種成分具有清除自由基作用，從而保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的損害有關［14］。

3.3 補腎益壽片對各組小鼠肝組織生化指標的影響 肝臟代謝旺盛，富含各種抗氧化酶，本結果表明， 中、 高劑量組的 SOD、 GSH-PX、T-AOC活力較模型組均有顯著性提高， MDA的水平顯著性降低，提示一定劑量的補腎益壽片可以清除肝臟中過多的自由基，從而提高肝臟的抗氧化能力，這可能與補腎益壽片中的成分提高肝臟抗氧化酶活力有關［15］。

3.4 補腎益壽片對各組小鼠腦組織生化指標的影響 MAO-B是一種老化酶，機體衰老時， 腦內的MAO-B活 力 會 急 劇 上 升［16-17］， 本 結 果 表 明， 中、高劑量組小鼠腦組織 MAO-B活力相較模型組顯著減弱，這可能與補腎益壽片中某些成分具有抑制腦內 MAO-B活性， 從而延緩衰老有關［18］； SOD和 TAOC活力相較于模型組顯著性增強， MDA水平顯著降低，提示一定劑量的補腎益壽片可以增強衰老小鼠腦組織的抗氧化活性，抑制脂質過氧化產物的形成。

綜上所述， 1 g/kg補腎益壽片 （中劑量組）即可使 D-半乳糖致衰老小鼠體內的各項生化指標接近正常水平，說明補腎益壽片對小鼠具有良好的抗衰老作用，補腎益壽片對人體是否有相似的作用，值得進行研究。

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Effect of Bushen Yishou Tablets on aged m ice induced by D-galactose

LIU Ming-juan1， YAN Li-you1， FAN Zhong-yuan2， GUO Ji-fang1， YANG Jian-xiong1*
（1.Shaanxi Normal University， Xi’ an 710119， China； 2.Institute of Special Animal and Plant， Changchun 130117， China）

AIM To explore anti-aging effects of Bushen Yishou Tablets on aged mice induced by D-galactose.METHODS Fiftymice were random ly divided into five groups.The control group were injected subcutaneously with saline solution， model group were injected subcutaneouslywith D-galactose in the napes and backs，and then sodium carboxymethyl cellulose solution was used to fill stomachs in both.Low， moderate， and high dose groups were injected with D-galactose in the nape subcutaneously and lavage was performed with different doses of Bushen Yishou Tablets.The index of spleen， the rate of weight gain， serum， liver， brain tissue superoxide dismutase（ SOD），glutathione peroxidase（ GSH-PX） ， and malondialdehyde（ MDA），total antioxidant capacity（ T-AOC） and brain tissuemonoamine oxidase（MAO） activity were collected after 42 days.RESULTS The results showed thatmoderate and high dose of Bushen Yishou Tablets could significantly inhibit the growth rates and increase index of spleen of aged rats induced by D-galactose.They could significantly decrease the activities of SOD， GSH-PX and the activity of T-AOC， and the concentrations of MDA and activities of MAO in brain decreased.CONCLUSION Bushen Yishou Tablets have strong anti-aging effect.

Bushen Yishou Tablets； anti-aging； D-galactose aging model； superoxide dismutase； glutathione peroxidase； malondialdehyde； monoamine oxidase； total antioxidant activity

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）05-0909-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.005

2013-09-15

劉明娟 （1989—） ， 女， 碩士， 從事天然產物的分離、 純化與功能評價。 Tel： 15029554385， E-mail： lmj0828@163.com

*通信作者： 楊建雄 （1954—） ， 男， 教授， 主要從事天然產物的分離、 純化與功能評價。 Tel：（ 029） 85307619， E-mail： jxyang@snnu. edu.cn