新胃乃安片的質量標準研究

梁小銀， 林文華， 嚴 萍， 蘇碧茹， 詹若挺， 陳蔚文*

（1 廣州中醫藥大學中藥資源科學與工程研究中心、 嶺南中藥資源教育部重點實驗室， 廣東 廣州 510006；2.廣州白云山中一藥業有限公司， 廣東 廣州 510530）

新胃乃安片的質量標準研究

梁小銀1， 林文華1， 嚴 萍1， 蘇碧茹2， 詹若挺1， 陳蔚文1*

（1 廣州中醫藥大學中藥資源科學與工程研究中心、 嶺南中藥資源教育部重點實驗室， 廣東 廣州 510006；2.廣州白云山中一藥業有限公司， 廣東 廣州 510530）

目的 建立新胃乃安片 （黃芪、 三七、 紅參、 人工牛黃和珍珠層粉） 的質量標準。方法 采用薄層色譜法對處方中的黃芪、 紅參和三七中的多種指標成分進行同時鑒別； 采用薄層色譜法對人工牛黃進行鑒別； 采用 HPLC-ELSD法對方中黃芪的黃芪甲苷進行測定。結果 薄層色譜特征明顯，在同一薄層板上能同時鑒別黃芪、紅參和三七藥材；黃芪甲苷在1.539 ～15.39 μg（r=0.999 8） 范圍內呈良好的線性關系， 其平均回收率 （n=6） 為 97.0% （RSD=1.5%）。 結論 建立的薄層色譜和 HPLC定量測定方法簡便、 重復性好， 專屬性強， 可用于新胃乃安片的質量控制。

新胃乃安片；黃芪；紅參；三七；黃芪甲苷；質量標準

胃乃安膠囊是國家中藥保護品種，是廣東省名老中醫梁乃津主任醫師的經驗方，由黃芪、三七、紅參、人工牛黃等組成，具有補氣健脾、活血止痛的功能，用于脾胃氣虛、淤血阻滯所致的胃痛，癥見胃脘隱痛或刺痛、納呆食少；慢性胃炎、胃及十二指腸潰瘍見上述 癥候者［1-3］。 其質量標準 現收載于 《中國藥典》2010 年版一部。 新胃乃安片為本課題組在保持胃乃安膠囊原處方不變的基礎上，以中醫藥理論為指導，以臨床療效為基礎，應用先進的現代中藥制劑新工藝、新設備、新技術和新材料對胃乃安膠囊進行二次開發而研制出的新劑型［4］。為有效控制該制劑質量，本研究建立了黃芪、紅參、三七以及人工牛黃的薄層色譜鑒別方法和黃芪甲苷的定量測定方法，為制定新胃乃安片的質量標準提供參考依據。

1 儀器與實驗材料

1.1 儀器 Waters e2695 高效液相色譜儀： （ 四元泵自動進樣系統）， Waters 2424 蒸 發光散 射檢測器， Empower化 學 工 作 站 （美 國 沃 特 世 公 司）；Milli-Q超純水設備 （法國 Millipore公司）； BS224S電子天平 （德國 Sartorius， 萬分之一）， XR205SMDR電子天平 （ 瑞士 Precisa， 十萬分之 一） ； KQ-700DE型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）； VISUALIZER薄層色譜數碼成像系統 （ 瑞士CAMAG公司）。

1.2 實驗材料 黃芪甲苷對照品 （批號 110781-200613）， 三 七 皂 苷 R1對 照 品 （ 批 號 110745-200617），人 參 皂 苷 Rb1對 照 品 （ 批號 110704-201122， 純度 92.9%）， 人參皂苷 Rg1對照品 （批號 110703-201027， 純 度 96.3%）， 膽 酸 對 照 品（批號 100078-200414）， 豬去氧膽酸對照品 （批號100087-200610， 純 度 97.3%）， 黃 芪 對 照 藥 材（膜莢黃芪， 批號 121462-201003）， 紅參對照藥材（批 號 121045-200503 ）， 三 七 對 照 藥 材 （ 批 號120941-200506）， 人 工 牛 黃 對 照 藥 材 （ 批 號121197-200502）， 以上對照物質均來源于中國藥品生物制品檢定所。新胃乃安片中試樣品 （批號20101002、 20110301、 20110302） 由廣州白云山中一藥業有限公司提供；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 黃芪、紅參、三七的鑒別 取本品適量，研細， 取 2 g， 加甲醇 50 mL， 超 聲處理 30 min，濾過， 濾液蒸干， 殘渣加水 20 m L， 微熱使溶解，用乙酸乙酯振搖提取 3 次， 每次 30 m L， 取下層水液， 用水飽和正丁醇振搖提取 3 次，每次 30 mL，合并正丁醇液， 用氨試液洗滌 2 次，每次 30 mL，棄去氨液， 正丁醇液蒸干， 殘渣加甲醇 0.5 mL使溶解， 作為供試品溶液。 取黃芪對照藥材2 g， 加甲醇50 mL， 同法制得黃芪對照藥材溶液。 取紅參對照藥材 0.5 g與三七對照藥材 0.7 g， 分別加水100 mL， 煎煮1 h， 濾過， 濾液分別用乙酸乙酯振搖提取 3 次， 每次 30 m L， 棄去乙酸乙酯液， 自“用水飽和正丁醇振搖提取”起，同法分別制得紅參、三七對照藥材溶液。另取黃芪甲苷對照品、人參皂苷 Rg1、 人參皂苷 Rb1及三七皂苷 R1對照品，加甲醇制成每1 m L各含1 mg的混合對照品溶液。再分別取相當量的黃芪陰性樣品和紅參、三七雙陰性樣品，分別同法制得黃芪陰性對照溶液及紅參、三七雙陰性對照溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述供試品溶液、各陰性對照溶液及對照品溶液各2 μL、黃芪對照藥材溶液 10 μL、 紅參對照藥材溶液6 μL、 三七對照藥材溶液1 μL， 分別點于同一硅膠 G薄層板上， 以正丁醇-乙酸乙酯-稀氨 （5→50）（4 ∶1 ∶5） 上層溶液為展開劑， 置用濃氨試液預飽和 20 min 的展開缸內，展開， 取出， 晾干， 噴以10%硫酸乙醇溶液， 在 105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；置紫外光燈（365 nm） 下檢視， 顯相同顏色的熒光斑點， 黃芪陰性、紅參、三七雙陰性對照均無干擾， 見圖1。

2.1.2 人工牛黃的鑒別 取本品適量， 研細， 取0.2 g， 加甲醇 20 mL， 超聲處理 30 min， 濾過， 濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解， 作為供試品溶液。 取人工牛黃對照藥材 10 mg，置 5 mL具塞試管中， 加甲醇 2 mL， 超聲處理 10 min， 離心， 取上清液作為對照藥材溶液。另取膽酸對照品、豬去氧膽酸對照品， 分別加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。再取相當量的人工牛黃陰性樣品，同法制得人工牛黃陰性對照溶液。照薄層色譜法試驗， 吸取上述溶液各 1 μL， 分別點于同一硅膠 G薄層板上， 以環己烷-乙酸乙酯-甲醇-乙酸 （20 ∶25 ∶3 ∶2）的上層溶液為展開劑， 展開，取出， 晾干， 噴以 10%硫酸乙醇溶液， 在 105 ℃加熱至斑點顯色清晰， 置紫外光燈 （365 nm） 下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾， 圖2。

圖1 新胃乃安片中黃芪、紅參、 三七的薄層色譜鑒別圖Fig.1 TLC chromatogram s of Astragali Radix， Ginseng Radix et Rhizome Rubra and Notoginseng Radix in Xin W einaian Tablets

2.2 樣品中黃芪甲苷測定

2.2.1 色譜條 件 Ecosil-C18色 譜柱 （250 mm× 4.6 mm， 5 μm）； 流動相為乙腈-水 （30 ∶70）； 柱溫 30 ℃； 體積流量 1.0 mL/min； 用蒸發光散射檢測器檢測， 漂移管溫度 55 ℃， 載氣體積流量30 psi（1 psi=6.895 kPa）， 增益值 200。

圖2 新胃乃安片中人工牛黃的薄層色譜鑒別圖Fig.2 TLC chromatogram of Calculus bovis factitius in Xin W einaian Tablets

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品 10.26 mg，置 20 mL量瓶中， 加甲醇溶解并稀釋至刻度， 搖勻， 制得質量濃度為 0.513 mg/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品 10 片， 精密稱定， 研細，取粉末約 1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中， 精密加入甲醇 50 mL， 密塞， 稱定質量，超 聲 處 理 （ 頻 率 為 40 kHz，功 率 為 280 W）30 min， 取出， 放冷， 再稱定質量， 用甲醇補足減失的質量， 搖勻， 濾過， 精密量取續濾液 25 mL，蒸干， 殘渣加水 20 m L， 微熱使溶解， 用水飽和正丁醇振搖提取 4 次， 每次 40 mL， 合并正丁醇液，用氨試液洗滌 2 次， 每次 40 mL， 棄去氨液， 正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至5mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度， 搖勻， 用 0.45 μm濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 專屬性試驗 按新胃乃安片處方、 制法制得缺黃芪藥材的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制得黃芪陰性對照溶液。取新胃乃安片供試品溶液與黃芪陰性對照溶液各 20 μL及黃芪甲苷對照品溶液 15 μL， 注入液相色譜儀， 按 “2.2.1” 項下的色譜條件測定。結果黃芪陰性對照溶液對試驗無干擾，見圖3。

圖3 黃芪甲苷專屬性試驗 HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram s of astragaloside IV in Xin W einaian Tablets

2.2.5 線性關系、 定量限及檢測限考察 分別精密吸取 “2.2.2” 項下的對照品溶液 （質量濃度為0.513 mg/m L） 3、 5、 10、 15、 20、 25、 30 μL注入液相色譜儀中， 各進樣 2 針， 按 “2.2.1” 項下的色譜條件測得峰面積，以峰面積的自然對數Y為縱坐標，以進樣量的自然對數X為橫坐標，繪制標準曲線并進行線性回歸計算，得標準曲線回歸方程 Y=1.698X+9.492， r=0.999 8。 結果表明黃芪甲苷進樣量在 1.539 ～15.39 μg范圍內的自然對數值與峰面積自然對數值呈良好的線性關系。此外，分別將黃芪甲苷對照品溶液稀釋至一定濃度，按 “2.2.1” 項下的色譜條件進行測定， 以信噪比為 10 ∶1 時， 計算出定量限為 1.539 μg； 以信噪比為 3 ∶1 時， 計算出檢測限為 0.769 5 μg。

2.2.6 重復性試驗 取同一批號質量差異項下的供試品 （ 批號： 20110301） 共 6 份， 每份 1.5 g，精密稱定， 按 “2.2.3” 項下的方法平行制備測定， 測得結 果 分 別 為 1.35、 1.35、 1.31、 1.34、1.32、 1.34 mg/片，平 均 含 有 量 （ n=6 ） 為1.34 mg/片， RSD為 1.2%。

2.2.7 日內精密度試驗 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液15 μL， 按 “2.2.2”項下的色譜條件， 連續 進 樣 6 次，記 錄 峰 面 積 分 別 為 440 835、440 143、 437 027、 439 880、441 029、 437 695，平均值為 439 434.8， RSD為 0.4%。

2.2.8 日間精密度試驗 取同一重復性試驗項下的供試品溶液， 連續進樣3 d， 每天進樣2次， 結果為第 1 天 1.37 mg/片， 第 2 天 1.36 mg/片， 第 3天 1.36 mg/片， 平均含有量為 1.36 mg/片， RSD為 0.4%。

2.2.9 穩定性試驗 取同一重復性試驗項下的供試品溶液分別于 0、 2、4、 8、 16、24 h 進樣測定，測得峰面積分別為 338 397、 346 021、347 572、349 977、 354 243、 338 397， 平均值為 345 768，RSD為 1.8%， 表明供試品 溶液在 24 h 內基本穩定。

2.2.10 加樣回收率試驗 精密稱取上述已知含有量的新胃乃安片供試品 （批號 20110301） 0.75 g，共6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入黃芪甲苷對照品溶液 （質量濃度為 1.681 mg/mL） 1.0 mL，按上述方法平行制備測定，計算回收率，結果見表1。

表1 黃芪甲苷的加樣回收率試驗結果Tab.1 Results of recovery tests for astragalosideⅣ

2.2.11 樣品測定 取 3 批供試品，每批平行 3份， 按上述方法制備測定，結果見表2。

表2 新胃乃安片中黃芪甲苷的測定結果Tab.2 Content of astragaloside IV in Xin Weinaian Tablets

3 討論

3.1 黃芪、 紅參、 三七的薄層鑒別 《中國藥典》 2010 年版一部胃乃安膠囊項下質量標準中皂苷類成分的鑒別只有三七中的三七皂苷 R1， 然而只對單一指標成分進行控制，遠遠不能達到有效控制中藥制劑質量的目的［5］。由于黃芪、紅參、 三七為胃乃安膠囊發揮藥效的主要藥味，三者含有的皂苷類成分均為其主要有效成分，且結構相似，因此本研究設計在同一色譜中同時鑒別黃芪中的黃芪甲苷、 紅參和三七中的人參皂苷 Rg1、 Rb1和三七皂苷 R1， 以求建立符合現代中藥制劑質量控制——多指標成分控制模式的鑒別方法。本研究曾比較了不同的展開系統： ①三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水 （15 ∶40 ∶22 ∶10） 10 ℃下層溶液［1，6］； ②三氯甲烷-甲醇-水 （13 ∶7 ∶2） 10 ℃下層 溶液［1，7-8］；③正丁醇-乙酸乙酯-稀氨 （5→50） （4 ∶1 ∶5） 上層溶液 （展開前，另槽加濃氨試液預飽和20 min）［9-10］。 結果展 開劑 ① 色譜的各主 斑 點的 Rf值較小，且黃芪甲苷與人參皂苷 Rg1斑點分離度達不到要求；展開劑②的黃芪甲苷與人參皂苷 Rg1斑點也分不開； 而展開劑③色譜各斑點 Rf值適中，斑點清晰，分離度好；另外還比較了展開劑③在展開前，不加濃氨試液預飽和以及將展開劑③的稀氨（5→50） 改為水， 展開前同樣不加濃氨試液預飽和 （即展開劑④： 正丁醇-乙酸乙酯-水 （4 ∶1 ∶5）上層溶液［11-12］） ， 結果發現展開劑③展開前加 濃氨試液預飽和的色譜各主斑點 Rf值較不加濃氨試液預飽和的稍高，且較展開劑④斑點集中，分離度好； 因此最終選擇展開劑③正丁醇-乙酸乙酯-稀氨（5→50） （4 ∶1 ∶5） 上層溶液 （展開前， 另槽加濃氨試液預飽和 20 min）作為本研究的展開劑。此外，由于制劑中黃芪、三七及紅參均為水煮提取，因此為了與供試品制備方法同步，對照藥材的前處理理應均采用水煮法，按本方量折算黃芪對照藥材應取7 g， 紅參對照藥材取 0.5 g， 三七對照藥材取0.7 g，本研究比較了黃芪對照藥材取7 g水煮與黃芪對照藥材取2 g甲醇超聲，結果二者色譜行為基本一致，考慮到黃芪對照藥材取7 g成本較高，給日后標準的執行增加困難，因此選擇黃芪對照藥材取2 g甲醇超聲提取，另由于紅參、三七對照藥材取樣量較少，因此采取水煮法提取。

3.2 成分測定 新胃乃安片是在保持胃乃安膠囊原處方量不變的基礎上制得，以黃芪作為君藥，投料量較大，其中黃芪甲苷為其藥理活性主要物質之一， 具有免 疫 調 節、 抗 炎 等 方 面 的 作 用［13-14］， 因此采用 HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷的量作為本制劑的質 量控 制 指 標［15-16］。 在樣 品 前 處理 時，曾 比較了以甲醇、乙醇和正丁醇為溶劑的超聲提取，以正丁醇超聲后氨試液洗滌提取，以甲醇超聲后正丁醇萃取氨試液洗滌提取，結果為甲醇超聲后正丁醇萃取氨試液洗滌提取的黃芪甲苷量最高，且發現有氨試液洗滌后提取的黃芪甲苷量遠遠高于無氨試液洗滌提取的；另外還考察了正丁醇的萃取次數以及氨試液洗滌次數，結果顯示以正丁醇萃取4次（每次40 mL） 和氨試液洗滌 2 次 （每次 40 mL）的效果最佳，該結果也與胃乃安膠囊質量標準中黃芪甲苷定量測定的提取方法相符。

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Quality standard for Xin W einaian Tablets

LIANG Xiao-yin1， LINWen-hua1， YAN Ping1， SU Bi-ru2， ZHAN Ruo-ting1， CHENWei-wen1
（1.Research Center of Chinese Herbal Resource Science and Engineering， Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine， Key Laboratory of ChineseMedicinal Resource from Lingnan， Ministry of Education， Guangzhou 510006， China； 2.Guangzhou Zhongyi Baiyunshan Pharmaceutical Company Limited， Guangzhou 510530， China）

Xin Weinaian Tablets； Astragali Radix； Ginseng Radix et Rhizome Rubra； Notoginseng Radix；astragaloside；quality standard

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）05-0990-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.023

2013-10-10

粵港關鍵領域重點突破招標項目 （GDDRC2007ZY002）

梁小銀 （1986—） ， 女， 碩士。 Tel： 18900868019， E-mail： lxyin2006@163.com

*通信作者： 陳蔚文 （1950—） ， 男， 教授， 博士生導師。 E-mail： chenww@gzucm.edu.cn