舒血寧注射液體外抑制血小板聚集的生物活性測定法

郭玉東， 胡宇馳， 曹春然， 王志斌*， 周建平， 左澤平， 高 陽， 王碧松

（1.北京市藥品檢驗所， 北京 100035； 2.北京中醫藥大學中藥藥理系， 北京 100102）

舒血寧注射液體外抑制血小板聚集的生物活性測定法

郭玉東1， 胡宇馳1， 曹春然1， 王志斌1*， 周建平1， 左澤平1， 高 陽2， 王碧松1

（1.北京市藥品檢驗所， 北京 100035； 2.北京中醫藥大學中藥藥理系， 北京 100102）

目的 建立舒血寧注射液 （銀杏葉提取物） 體外抑制血小板聚集的生物活性測定法用于補充其質量控制方法。方法 以抑制家兔血小板聚集作用來考察顯示舒血寧注射液量效關系和效價測定。結果 舒血寧注射液對凝血酶和膠原誘導的血小板聚集無明顯的抑制作用， 效價測定為 100 U/mL。 結論 舒血寧注射液抑制血小板聚集的生物活性測定法可靠，重復性良好，穩定性較好，可作為質量控制。

舒血寧注射液；血小板聚集；生物活性測定法；質量控制

舒血寧注射液為銀杏葉提取物制劑，通過長期的研究，藥理機制和臨床應用都得到了廣泛認可、全面認識和深入研究。 北京市藥品檢驗所在 2009年國家中藥注射劑評價性抽驗中，發現不同生產企業的舒血寧注射液質量存在差異，表明現行的質量控制方法存在一定缺陷。金納多注射液與舒血寧注射液主要成分相同，僅生產工藝有所差異，在本研究中作為對照。

中藥成分復雜，而單一的控制少數指標性成分難以控制藥物的有效性和安全性，這就迫使我們對現有的中藥質量控制方法進行改進［1］。 生物檢定法最近幾年日趨成熟，并且在某些西藥質量控制中生物檢定法已經占據了主導地位， 《中國藥典》2010 年版一部中， 增加了中藥的生物活性測定研究指導原則［3］， 說明在中藥尤其是中藥注射劑質量標準中增訂生物活性測定項，已經是一種方向［2］。 如果能夠率先在質量標準中制定生物活性測定項，必將大大推動中藥的發展，使其有質的飛躍。因此生物活性測定法用于中藥質量控制已是一種必然的趨勢。

前期藥效學研究發現舒血寧注射在體內外對血小板聚集均具有較好的抑制作用，并且具有明確的劑量依賴關系，因此本實驗嘗試建立舒血寧注射液體外抑制血小板聚集的生物活性測定法，量化舒血寧注射液的活血化瘀作用，對其質量控制方法進行補充，更好的指導舒血寧注射液的臨床使用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 普通級日本大耳白家兔， 許可證號 SCXK （ 京）2006-0009，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.2 實驗試劑 5 μmol/L二磷酸腺苷 （ADP， 北京世帝科學儀器公司）； 凝血酶 （中國藥品生物制品檢定所），批號 140605-200824； 血小板活化因子 （PAF） （ACROS），批號 A0208208001； 0.9%氯化鈉注射液 （中國大冢制藥有限公司）， 批號0B72H2； 枸櫞酸納 （北京化學試劑公司）， 批號20080904； 滅菌注射用水 （大同市惠達藥業有限責任公司），批號 0907261。 金納多注射液 （5mL/支）， 批號 D2118； 舒血寧注射液 （5 m L/支）， 批號 100707。

1.3 實驗儀器 LG-PABER-Ⅰ型血小板聚集凝血因子分析儀 （北京世帝科學儀器公司）， DT5-1 離心機 （北京時代北利離心機有限公司）， MEK-6318 血液分析儀 （北京健長醫療器械有限公司）。

2 實驗方法

2.1 血漿制備 家兔采取頸總動脈放血 75 mL，加 3.8%枸櫞酸納 （1 ∶9） 抗凝， 1 000 r/min 離心10 min 制備富血小板血漿 （PRP）， 剩余血樣繼續3 500 r/min 離 心 10 min 制 備 貧 血 小 板 血 漿（PPP）。

用血液分析儀測定 PPP和 PRP中的血小板數，PPP中血小板數一般在 5 ×109個/L以下， 利用PPP調節 PRP中的血小板數在 4.0 ×1012～4.5 × 1012個 /L之間［4］，為保證測量的準確性， 血小板聚集的測定應在4 h 內完成， 且PRP不可冷凍保存和過度震蕩［5］。

2.2 測試樣品配制 取金納多注射液 1 支，用0.9%的生理鹽水分別配制成劑間比為 0.85， 配制梯度為 85%、 72%、 61%、 52%、 44%的樣品液各1 mL， 作為對照品， 取舒血寧注射液 1 支， 用0.9%的生理鹽水分別配制劑間比為 0.85， 配制梯度為 85%、 72%、61%、 52%、 44%的樣品液各1 m L， 為供試品。

2.3 血小板聚集測定 取 PPP 210 μL加入測試杯， 進行儀器調零。 再取 PRP180 μL［6-7］， 分別加入不同質 量分數 的 樣 品 液 20 μL，37 ℃ 孵 育 180 s［8］， 分別加入聚集誘導劑 10 μL， 測定 5 min內的最大聚集率［9］。

2.4 舒血寧注射液生物活性測定

2.4.1 量效關系考察 取舒血寧、 金納多注射液，用 0.9%氯化鈉注射液精確稀釋為含舒血寧、 金納多注射液 44%、 52%、 61%、 72%、 85%和 100%（原液） 的 6個不同質量分數稀釋液， 劑間比為0.85， 依 “2.3”項下方法，分別測定含藥血漿的血小板最大聚集率。

2.4.2 效價測定 取金納多注射液， 用 0.9%氯化鈉注射液精確稀釋為含金納多注射液 72%、85%和 100% （原液） 的 3 個不同質量分數稀釋液， 劑間比 0.85，作為對照品組 （S）； 取舒血寧注射液， 用 0.9%氯化鈉注射液精確稀釋為含舒血寧注射液72%、 85%和100% （原液） 的3 個不同質量分數稀釋液， 劑間比 0.85， 作為供試品組（T）。依 “2.3” 項下方法， 分別測定對照品組和供試品組含藥血漿的血小板最大聚集率。 按照 S1、T1、 T2、 S2、 S3、 T3 的順序 （排除因 S 組和 T組測定的先后次序引起的誤差）， 平行測定3次。 按《中國藥典》 生物檢定統計法中量反應平行線三三法進行統計學處理，考察結果的可靠性，計算T組的效價 （PT） 和可信限率 （FL%）。

3 實驗結果與討論

3.1 量效關系考察結果 由前期預試發現， 舒血寧注射液與金納多注射液均對凝血酶和膠原誘導的血小板聚集無明顯的抑制作用，因此實驗中只選擇ADP和 PAF兩種誘導劑進行試驗。 以對數轉換后血小板最大聚集率為縱坐標，藥物百分含有量為橫坐標， 結果見表1 ～2。 由于血小板最大聚集率經對數轉換后與藥物百分含有量所成的線性關系，較不轉換前線性更好，相關系數更高，因此考察線性關系和計算效價時均對血小板最大聚集率進行對數轉換。

表1 舒血寧注射液對不同誘導劑誘導的血小板最大聚集率的影響Tab.1 Effect of Shuxuening Injection on platelet maximum aggregation rate induced by different inducers

表2 金納多注射液對不同誘導劑誘導的血小板最大聚集率的影響Tab.2 Effect of Jinnaduo Injection on plateletmaximum aggregation rate induced by different inducers

由表1～2可以看出對于 ADP誘導的血小板聚集，舒血寧注射與金納多注射液的抑制作用無明顯差別， 對于 PAF誘導的血小板聚集， 金納多注射液的抑制作用較強于舒血寧注射液。

對表1～2數據中藥物濃度與對數轉換后的血小板最大聚集率進行線性考察，發現舒血寧注射液與金納多注射液對ADP和 PAF誘導的血小板聚集，均有較好的線性關系 （r2均大于 0.96）， 其中對于PAF誘導的聚集兩種注射液所得線性關系更好， r2均大于0.99， 由此可見舒血寧注射液與金納多注射液對ADP和 PAF誘導血小板聚集均有較好的抑制作用，并成劑量依賴性，隨著藥物濃度的增大，其抑制作用越強，血小板聚集率越低。

3.2 效價測定與可靠性考察 由于金納多注射液在 《中國藥典》 2010 年版及國外藥典上未見效價的規定， 因此假設對照品 （S） 金納多注射液的效價為 100 U/mL， 由于舒血寧注射液與金納多注射液成分相同，且基本成分的含有量也相同，如果舒血寧注射液抑制血小板聚集的效果與金納多相同，則其測得效價也應為 100 U/mL， 結果見表 3。

表3 舒血寧注射液由 ADP、 PAF誘導的測得效價與可信限率Tab.3 M easured titer and rate of confidence lim it of Shuxuening Injection induced by ADP and PAF

由表4和表5可靠性檢驗得，兩種誘導劑誘導的血小板聚集可靠性檢驗均合格， 回歸顯著 （P＜0.01）， 偏離平行、 二次曲線、 反向二次曲線均不顯著 （P＞0.05）， 可信限率均小于 10%， 以上結果表明該方法得到的測得效價可靠。其中舒血寧ADP誘導的測得效價與金納多相差較小，且試品間可靠性檢驗無顯著性差異 （P＞0.05）， 說明對于ADP誘導的血小板聚集， 舒血寧注射液的抑制作用與金納多差別不明顯。 舒血寧 PAF誘導的測得效價與金納多相差較大，并比金納多小，且試品間可靠性檢驗有顯著性差異 （P＜0.01），進一步驗證了對于 PAF誘導的血小板聚集， 金納多注射液的抑制作用強于舒血寧注射液。由以上結果可以看出，雖然舒血寧注射液與金納多注射液主要成分含有量相同，但測得效價卻不相同，說明兩種注射劑質量存在一定差異。

表4 舒血寧注射液由 ADP誘導效價測定的可靠性檢驗結果Tab.4 Results of reliability test of titer determ ination of Shuxuening Injection induced by ADP

表5 舒血寧注射液由 PAF誘導效價測定的可靠性檢驗結果Tab.5 Results of reliability test of titer determ ination of Shuxuening Injection induced by PAF

3.3 重復性考察 取同一血漿為試驗系， 按照血小板聚集的測定方法，測定舒血寧注射液相對金納多注射液相對生物效價，重復測定6次，并進行可靠性檢驗，結果見表6 ～7。

由表 6 ～7 可見，舒血寧注射液經 ADP、 PAF誘導的血小板聚集的相對生物效價，6次分別測定結果的可靠性檢驗均合格， 回歸顯著 （P＜0.01），偏離平行、二次曲線、反向二次曲線均不顯著（P＞0.05），可信限率均小于10%， 測得效價平均值的 RSD均小于5%， 因此說明用血小板聚集的方法測定出舒血寧注射液的生物效價方法可靠，重復性較好，具有一定的可行性。

表6 舒血寧注射液對 ADP誘導血小板聚集的相對生物效價重復性考察Tab.6 Relative biological titer reproducibility of platelet aggregation in b lood of Shuxuening Injection induced by ADP

表7 舒血寧注射液對 PAF誘導血小板聚集的相對生物效價重復性考察Tab.7 Relative biological titer reproducibility of p latelet aggregation in b lood of Shuxuening Injection induced by PAF

4 結論

由上述結果可以看出， 舒血寧注射液對 ADP、PAF誘導的體外血小板聚集有較好的抑制作用， 并且劑量依賴性明顯。通過線性關系考察發現，均具有良好的線性關系，可靠性檢驗均合格表明該方法得到的測得效價可靠。重復性考察表明，建立的兩種誘導劑誘導體外血小板聚集的生物檢定方法學，重復性較好，測定出舒血寧注射液的生物效價可靠，具有一定的可行性，可以進行深入的研究。

由于舒血寧注射液和金納多注射液主要成分含有量相同，建立的舒血寧注射液的生物效價方法可靠，如果兩種注射劑療效相同，則測得效價應無差別，但實際測的效價差異較大，說明兩種注射劑的質量存在一定差異，這也進一步說明單從成分控制舒血寧的質量存在缺陷，需要進一步提高。

目前中藥生物活性測定法還處在起步階段［10-11］， 該方法的關鍵 問題是 指標和對照品確立，由于目前舒血寧注射液還沒有對照品，因此本實驗選擇與舒血寧注射液同質的金納多注射液作為標準品，并假定其效價，測定舒血寧注射液的效價。如果能夠建立一批針對抑制血小板聚集活性的舒血寧注射液 對照 品， 并通 過 協 作標 定［12-14］， 確 定 其 穩定性，必將極大的推進舒血寧注射液生物活性測定法進步，真正意義上量化其活性，規定合格范圍，控制舒血寧注射液的質量。

測定體外血小板聚集實驗時， 離心完的 PRP與 PPP血漿一定要用血液分析儀測定其血小板數，盡量保證每次實驗 PRP血漿中的血小板數基本相同， 若 PRP中的血小板數過高， 可以用 PPP進行調節；過低時可降低離心的轉速，以保證血小板數在合適范圍內。制備好的血漿最好在4 h內完成測定，時間過長血漿的穩定性會下降。操作過程中避免過度震蕩，過度震蕩也會使血漿的穩定性下降，避免冷藏，低溫會加速血小板聚集，以上操作均能使測量結果有較大的誤差，操作過程中應當注意。

影響體外血小板聚集實驗的因素較多，為了保證每次實驗結果的準確性，應建立相應的標準操作規程，不同實驗室均應按照此操作規程進行實驗，使實驗結果具有可比性，加快該方法在不同實驗室的應用。

由于舒血寧注射液體外抗血小板聚集的實驗操作簡單、快速、準確、費用低，便于建立的生物活性測定方法［15］， 利于在藥檢部門推廣。 該方法對舒血寧注射液的質量控制方法進行了很好的補充，使其質量控制方法更加完善，保證其臨床使用的安全有效。由于活血化瘀類注射劑多具有抑制血小板聚集的作用，可以嘗試著將這種方法在該類注射劑質量控制中應用，為中藥質量控制方法提供新的思路。

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Bioassay m ethod of Shuxuening Injection to inhibit p latelet aggregation

GUO Yu-dong1， HU Yu-chi1， CAO Chun-ran1， WANG Zhi-bin1*， ZHOU Jian-ping1，ZUO Ze-ping1， GAO Yang2， WANG Bi-song1
（1.Beijing Institute for Drug Control， Beijing 100035， China； 2.Department of Chinese Herbal Pharmacology， Beijing University of ChineseMedicine，Beijing 100102， China）

AIM To establish a bioassaymethod of Shuxuening Injection （Ginko Folium） to inhibit the plateletaggregation for the supplementary of its quality control.METHODS The pharmacological activity of platelet aggregation of rabbit blood was used for the examination of dose-effect relationship and titer of Shuxuening Injection.RESULTS The inhibitory effect of Shuxuening Injection on platelet aggregation induced by thrombin and gelatin was not distinct，and the determined titer was 100 U/mL.CONCLUSION The bioassay method of platelet aggregation of Shuxuening Injection is reliable with good reproducibility and stability，and can serve as its quality control to some extent.

Shuxuening Injection； platelet aggregation； bioassaymethod； quality control

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）05-1008-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.027

2013-05-11

郭玉東 （1984—） ， 男， 主管藥師， 碩士， 主要從事藥品安全性評價試 驗。 Tel： （010） 83288837， E-mail： guoyudong23@ 126.com

*通信作者： 王志斌， 研究員， 主要從事藥品標準及藥物活性研究。 Tel： （010） 83220757 ， E-mail： wangzhibin4804@sina.com