五子衍宗丸對 ATRA誘導的神經管畸形防治作用初探

樊慧杰， 柴 智， 解 軍， 王永輝， 周 然*

（1.山西中醫學院， 山西 太原 030024； 2.山西醫科大學， 山西 太原 030001）

五子衍宗丸對 ATRA誘導的神經管畸形防治作用初探

樊慧杰1， 柴 智1， 解 軍2， 王永輝1， 周 然1*

（1.山西中醫學院， 山西 太原 030024； 2.山西醫科大學， 山西 太原 030001）

目的 初步研究五子衍 宗 丸 對 全 反 式 維 甲 酸 （ all-trans-retinoic acid， ATRA） 誘 導 的 神經管畸形 （ neural tube defects， NTDs） 的防治作用， 并篩選出五子衍宗丸防治 NTDs的最佳給藥方式。 方法 BALB/c雄鼠和雌鼠以 1 ∶2 比例合籠， 有陰栓者為孕鼠。 將 110 只孕鼠隨機分為正常組、 模型組、 五子衍宗丸先給組、 五子衍宗丸和 ATRA同時干預組、 五子衍宗丸后給組， 后 3 組又各分為五子衍宗丸高 （4.20 g/kg）、 中 （2.10 g/kg）、 低 （1.05 g/kg） 劑量 3 個亞組。 孕11 d時處死各組孕鼠， 解剖取出子宮， 顯微鏡下分離胚胎， 光鏡鑒定神經管畸形， 計算發生率。 結果 與正常組比較， 除五子衍宗丸高劑量先給組的差異無統計學意義 （P ＞0.05）， 其余各組均有統計學差異 （P＜0.05）。與模型組比較， 五子衍宗丸中、 高劑量先給組， 五子衍宗丸中、 高劑量和 ATRA同時干預組神經管畸形發生率顯著降低， 差異均有統計學意義 （P＜0.05）； 但是五子衍宗丸中、 高劑量后給組和五子衍宗丸低劑量各組神經管畸形發生率的差異無統計學意義 （P＞0.05）。 分別與五子衍宗丸中、 高劑量和 ATRA同時干預組比較， 五子衍宗丸中、 高劑量先給組神經管畸形發生率的差異無統計學意義 （P＞0.05）。 分別與五子衍宗丸中劑量先給、 同時給予組比較， 五子衍宗丸高劑量先給、 同時給予組神經管畸形發生率的差異無統計學意義 （P＞0.05）。 結論 五子衍宗丸對 ATRA誘導的神經管畸形有防治作用； 本實驗中 4.20 g/kg五子衍宗丸預先給藥是防治神經管畸形的最佳給藥方式。

五子衍宗丸；神經管畸形；腎主生殖

神經管畸形是一種影響腦和脊髓的先天性新生兒出生缺陷［1］， 表現為無腦畸形、 腦積水和脊柱裂等［2］。 我國北方是神經管畸形的高危地區， 發病率為 5.57 ‰， 是世界平均發病率的 10 倍［3-5］。 神經管畸形 病因復 雜， 環境因素和遺傳因素均可引發神經管畸形。目前只通過口服葉酸未能完全阻斷神經管畸形的發生。來源于父母的先天之精構成胚胎， 若 “腎精不足” 則可致先天性發育異常。 五子衍宗丸為 《攝生眾妙方》 中的補腎方劑， 方中各藥共發揮補腎益精之效。 本研究給孕鼠灌胃全反式維甲酸 （ATRA） 建立小鼠神經管畸形模型，分別在模型建立前、同時、后給予補腎方劑五子衍宗丸對孕鼠進行干預，觀察五子衍宗丸對神經管畸形的防治作用，篩選出五子衍宗丸防治神經管畸形的最佳劑量和最佳給藥時間。

1 材料

1.1 動物 健康成年 BALB/c小鼠， 雌雄比例為 2 ∶1， 體質量 （23 ±2） g， 由北京華阜康生物科技股份有限公司提供， 動物合格證號 SCXK （京） 2009-0004。 飼養環境通風良好， 自由攝取水食， 按晝夜節律自然照明、 室溫 （22 ± 2） ℃、 濕度 45% ～55%。

1.2 藥物和試劑 五子衍宗丸 （由枸杞子、 菟絲子、 覆盆子、五味子、車前子組成）由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠生產 （批號 2035248）， 用蒸餾水將成藥配制為混懸液， 給予小鼠灌胃的高、 中、 低劑量分別是 4.20、2.10、 1.05 g/kg（劑量按體表面積折算， 分別相當于成人臨床推薦日用量的 2 倍、 1 倍、 0.5 倍）。 ATRA購于美國Sigma公司。

1.3 儀器 BS224S 型萬分之一電子天平 （德國賽多利斯集團）； KQ-300VDE超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）； SMZ-168 體視顯微鏡 （麥克奧迪實業集團有限公司）。

2 方法

2.1 建立神經管畸形胎鼠模型 BALB/c雄鼠和雌鼠 1 ∶2比例于中午12時合籠， 次日早上8時分籠并檢查陰栓， 有陰栓者為孕鼠。 將發現陰栓的當天中午 12 時定為胚胎（embryo， E） 0.5 d。 用香油溶解 ATRA粉末， 按 50 mg/kg劑量灌胃干預 E7d 孕鼠， 正常組灌服等體積的香油。 課題組前期研究發現， 用 ATRA對 E7d 孕鼠進行干預， 胎鼠于E9.5d 開始出現神經管畸形， 且神經管畸形發生進程一直到 E11.5d （神經管發育完成） 結束， 所以本實驗 選取E11d 胎鼠進行研究。 解剖 E11d 孕鼠取出胎鼠， 參照正常組，光鏡下觀察胎鼠神經管的形態，鑒定神經管畸形的發生［6］。

2.2 分組及給藥

2.2.1 分組 ①正常組、 ②模型組、 ③五子衍宗丸先給組、 ④五子衍宗丸和 ATRA同時干預組、 ⑤五子衍宗丸后給組。③、④、⑤組又分別按照五子衍宗丸高、中、低劑量的不同分為3個亞組。 每組10只孕鼠， 以其胎鼠為研究對象。

2.2.2 給藥 模型組孕鼠分別在 E4d、 E5d、 E6d 灌胃給予蒸餾水， 每天 1 次， 連續 3 d， E7d 一次性灌胃給予孕鼠ATRA， 在 E8d、 E9d、 E10d 灌胃給予蒸餾水， 每天 1 次，連續3 d。 五子衍宗丸先給組的3個亞組按五子衍宗丸高、中、 低劑量在 E4d、 E5d、 E6d 灌胃給予孕鼠， 每天 1 次，連續 3 d， E7d 一次性灌胃給予孕鼠 ATRA， 在 E8d、 E9d、E10d 灌胃給予蒸餾水， 每天 1 次， 連續 3 d。 五子衍宗丸和 ATRA同時干預組的 3 個亞組在 E4d、 E5d、 E6d 灌胃給予蒸餾水， 每天1次， 連續3 d， 按五子衍宗丸高、 中、 低劑量在 E7d 一次性灌胃給予孕鼠， 同時灌胃給予孕鼠 ATRA， 在 E8d、 E9d、 E10d 灌胃給予蒸餾水， 每天 1 次， 連續 3 d。 五子衍宗丸后給組的 3 個亞組在 E4d、 E5d、 E6d灌胃給予蒸餾水， 每天 1 次， 連續 3d， 在 E7d 一次性灌胃給予孕鼠 ATRA， 在 E8d、 E9d、 E10d 按五子衍宗丸高、中、 低劑量灌胃給予孕鼠， 每天1次， 連續3 d。 正常對照組孕鼠在 E4d ～E10d 時間段， 除 E7d 給予等體積香油外，其余時間給予等體積的蒸餾水，每天1次。灌胃體積均為20 mL/kg， 稱重并根據體質量調整給藥量。

2.3 樣品制備及指標檢測 E11d 時頸椎脫臼法處死各組孕鼠，仰臥固定四肢于手術臺上。于腹中線剪開皮膚和肌肉，暴露腹腔，可見子宮，剪斷子宮系膜，將成串子宮取出， 用 PBS 清洗后， 移入盛有 PBS 的玻璃培養皿中， 解剖顯微鏡下小心剝離胎盤和胎膜組織，取出胚胎，光鏡下鑒定神經管畸形的發生情況，用神經管畸形發生率 （每只孕鼠神 經 管 畸 形 胎 鼠 數/每 只 孕 鼠 總 胎 鼠 數 ×100%）表示［6］。

2.4 統計學處理 采用 SPSS 17.0 統計軟件分析數據， 所得結果 用表 示。 應 用 單 因 素 方 差 分 析 （ one-way ANOVA） 比較各組間均數。 P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 神經管畸形胎鼠模型的形態學鑒定 正常組孕鼠的胚胎數為7 ～15 個， 母鼠子宮無充血， 吸收胎少見， 解剖顯微鏡下可見多為活胎、偶有死胎、無畸形胎，活胎外形完整圓潤飽滿、腦泡閉合完全、脊柱表面無可見裂口、神經管正常閉合。模型組孕鼠子宮有充血瘀血現象，吸收胎多見，解剖顯微鏡下可見活胎發育遲緩、死胎增多、有神經管畸形胎，神經管畸形胎外觀瘦小、形態崎嶇各異、不完整，可見無腦、脊柱裂、甚有整個神經管未閉合的現象。造神經管畸形胎鼠模型成功。

3.2 五子衍宗丸對胎鼠神經管畸形的干預結果 與正常組比較，除五子衍宗丸高劑量先給組的差異無統計學意義（P＞0.05）， 其余各組差異均有統計學意義 （P＜0.05）。與模型組比較，五子衍宗丸中、高劑量先給組，五子衍宗丸中、 高劑量和 ATRA同時干預組胎鼠神經管畸形發生率明顯降低， 差異均有統計學意義 （P＜0.05）； 但是五子衍宗丸中、高劑量后給組和五子衍宗丸低劑量組 （先給、同時、 后給） 神經管畸形發生率的差異無統計學意義 （P＞0.05）。 將對神經管畸形有防治作用的 4 組進行劑量之間、給藥時間之間的比較；分別與五子衍宗丸中、高劑量和ATRA同時干預組比較， 五子衍宗丸中、 高劑量先給組胎鼠神經管畸形的發生率有降低趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。 分別與五子衍宗丸中劑量先給、 同時給予組比較，五子衍宗丸高劑量先給、同時給予組胎鼠神經管畸形的發生率有降低趨勢，但差異無統計學意義 （P＞0.05）。 見表 1。

表1 五子衍宗丸對胎鼠神經管畸形發生率的影響 （，n=10）

表1 五子衍宗丸對胎鼠神經管畸形發生率的影響 （，n=10）

注： 與模型組比較，*P＜0.05； 與正常組比較，▲P＜0.05

組別 劑量/（ g·kg-1）神經管畸形發生率/%正常組-0模型組 - 54.00 ±15.06▲五子衍宗丸高劑量先給組 4.20 9.00 ±3.16*五子衍宗丸中劑量先給組 2.10 19.00 ±7.38*▲五子衍宗丸低劑量先給組 1.05 47.00 ±12.52▲五子衍宗丸高劑量和 ATRA同時干預組4.20 16.00 ±6.99*▲五子衍宗丸中劑量和 ATRA同時干預組2.10 24.00 ±7.01*▲五子衍宗丸低劑量和 ATRA同時干預組1.05 52.00 ±14.76▲五子衍宗丸高劑量后給組 4.20 44.00 ±9.66▲五子衍宗丸中劑量后給組 2.10 51.00 ±11.97▲五子衍宗丸低劑量后給組 1.05 52.00 ±13.17▲

4 討論

精包括 “先天之精” 和 “后天之精”［7］。 《醫宗金鑒·卷二十六·刪補名醫方論卷一》云： “先身而生， 謂之先天”， 以及張錫純所言 “以未生為先天， 已生為后天者”，則 “出生” 是 “ 先天” 和 “后天” 的分界線［8］。 子代先天之精受于父母生殖之精，是構成胚胎的原始物質；后天之精則是由自己臟腑所化生，是水谷之精微。有學者提出，“先天之精” 指的是遺傳信息的內容和遺傳信息讀取全過程即中心法則，而遺傳信息的化學存在方式和遺傳信息讀取過程的化學存在方式是腎臟的 “后天之精”； “先天之精” 和 “后天之精” 的關系是過程和實體、 信息和物質的關系［9］。 顯然 “ 先 天之精” 是 決定人 生 長 發 育 的 基 礎?！鹅`樞·經脈》曰： “人始生， 先成精， 精成而腦髓生……”，說明先天稟受的父母之精化生腦髓。若先天稟賦不足，髓海失充，元神失養，可導致大腦先天發育異常。神經管畸形是先天性發育異常的疾病，腦積水、學習障礙、腿部癱瘓、大小便失禁等臨床表現與中醫所言 “腎精不足”內涵密切相關。所以，神經管畸形屬于中醫先天稟賦不足之范疇，腎精虧損為其主要原因。五子衍宗丸中菟絲子溫腎益精，枸杞子滋腎填精，兩藥相合陰陽并補，共為君藥；五味子益氣補虛強陰澀精，覆盆子溫腎而不燥固精而不凝，共為臣藥；車前子澀中兼通，補而不滯，用為佐藥［10］。 全方共奏補腎益精之功， 理論上恰可對證神經管畸形胎兒的先天稟賦不足之源。

本實驗用五子衍宗丸對孕鼠進行不同時期的干預，在E11d 時解剖孕鼠鑒定神經管畸形的發生情況。 實驗發現，對神經管畸形有防治作用的4組分別是五子衍宗丸高劑量先給組、五子衍宗丸中劑量先給組、五子衍宗丸高劑量和ATRA同時干預組、 五子衍宗丸中劑量和 ATRA同時干預組；低劑量組和五子衍宗丸后給組均無防治作用；結合各干預組與正常組的比較結果， 顯示出高劑量4.20 g/kg的五子衍宗丸預先給藥是防治神經管畸形的最佳給藥方式。本實驗為后續的五子衍宗丸干預神經管畸形的機制研究奠定了基礎，同時為臨床防治神經管畸形提供了一種新的思路。

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R285.5

： B

： 1001-1528（2014）05-1054-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.038

2013-07-18

國家自然科學基金項目 （81102552）

樊慧杰 （1978—）， 女， 博士， 講師， 研究方向： 中藥分子生物學。 Tel： （0351） 2272378， E-mail： fanhuijie.happy@163.com

*通信作者： 周 然 （1958—） ， 男， 博士， 教授， 博士生導師， 研究方向： 方劑效用及其物質基礎。 Tel： （0351 ） 2272390， E-mail：zhour58@sohu.com

日期： 2013-09-04

網絡出版地址： http： //www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20130904.1321.001.htm l