酶法提取茅蒼術多糖工藝條件研究

凡軍民， 宋 剛， 張 萍， 李 靜

（江蘇農林職業技術學院， 江蘇 句容 212400）

酶法提取茅蒼術多糖工藝條件研究

凡軍民， 宋 剛， 張 萍， 李 靜

（江蘇農林職業技術學院， 江蘇 句容 212400）

目的 確定酶法提取茅蒼術多糖的最佳工藝條件。方法 采用響應面分析法研究各因素對酶法提取茅蒼術多糖提取率的影響。 結果 提取的最佳工藝條件為： 纖維素酶加量 0.32%、 酶解溫度 53 ℃、 酶解時間 92 min、 液料比23 ∶1。 結論 在此最佳條件下， 茅蒼術多糖的提取率為 35.78%， 采用纖維素酶水解能顯著提高茅蒼術多糖提取率。

纖維素酶；茅蒼術；多糖；提取；響應面分析法

茅蒼術 Atractylodes lancea （ Thunb.） DC.也稱南蒼 術，系菊科蒼術屬多年生草本植物。江蘇句容茅山為其道地產區， 因而得名茅蒼術。 據 《神農本草經》 記載［1］， 茅蒼術性溫，味甘、苦；歸脾、胃、肝經；具有燥濕健脾、祛風散寒、明目的功效。茅蒼術中主要含有揮發油、多糖等活性成分， 國內外研究表明［2-5］， 茅蒼術具有抗潰瘍、 抗心率失常、降血壓、利尿、保肝、抗炎、抗菌、抗缺氧、中樞抑制及推動胃腸道蠕動等作用。近年來有報道茅蒼術多糖具有腸免疫活性、 抗假絲酵母菌感染等作用［6-7］。 酶法用于中藥有效成分提取，能縮短提取時間，保持有效成分藥效，提高有效成分的提取率，且操作簡便，對設備要求不高，條件溫和，在中藥的有效成分提取中有較大的應用潛力。本研究采用響應面分析法建立了茅蒼術多糖纖維素酶酶解的工藝，為進一步研究茅蒼術的活性與應用提供依據。

1 儀器與試劑

1.1 材料 茅蒼術根莖， 采自江蘇省句容市茅山地區。

1.2 試劑 纖維素酶 （酶活力≥1.5 ×105U/g， 國藥集團化學試劑有限公司）， 葡萄糖、 濃硫酸、 苯酚、 3，5-二硝基水楊酸、亞硫酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉均為分析純。

1.3 儀器 DHG-9143BS-Ⅲ電熱恒溫鼓風干燥箱 （上海圣科儀器設備有限公司）， YS-10 高速粉碎機 （北京燕山正德機械設備有限公司）， FA1104 電子天平 （上海良平儀器儀表有限公司）， HH-4 數顯恒溫水浴鍋 （金壇市富華儀器有限公司）， UV762 紫外-可見分光光度計 （上海精密科學儀器有限公司）。

2 方法

2.1 茅蒼術多糖的提取 取茅蒼術根莖清洗去雜、 切片，60 ℃烘干至恒定質量， 按料液比1 ∶5 （m/V） 加入 95%乙醇， 65 ℃回流提取 3 次， 每次 1 h， 過濾。 將去脂的茅蒼術片晾干、 粉碎、 過 60 目篩。 準確稱取 1.000 g茅蒼術干粉，用蒸餾水提取，過濾，濾液加水定容。分別測定總糖、單糖的量，計算茅蒼術多糖含有量及提取率。

2.2 茅蒼術多糖的測定及提取率計算

2.2.1 總糖測定［8］采用苯酚-硫酸法。 （1） 標準曲線繪制： 準確稱取 105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對照品10 mg， 將其定容于100mL量瓶中， 得到100 μg/mL的葡萄糖標準溶液。 分別吸取標準溶液 0、 0.3、 0.6、 0.9、 1.2、 1.5 mL于試管中， 加水至總體積 2.0 mL， 加入 5%苯酚 1 mL， 混勻后迅速加入濃硫酸 5 mL， 搖勻， 室溫放置 20 min 冷卻后于 490 nm測吸光度。 橫坐標為多糖毫克數， 縱坐標為吸光度， 得標準曲線。 （2） 樣品測定： 吸取樣液 1.0 mL（相當于40 μg左右的多糖）， 按上述步驟操作， 測定吸光度， 以標準曲線計算總糖含有量。

2.2.2 還原糖測定［8］采用 DNS 法。 精確吸取樣品液 1 m L（含糖 50 ～100 μg左右）， 1 mg/mL的葡萄糖標準溶液1 mL， 分別置于25mL量瓶中， 各加1.5mLDNS 試劑， 搖勻置沸水浴中加熱 5 min， 迅速用涼水冷卻。 分別加水至刻度， 搖勻。 以水1mL按同樣方法操作所得溶液作空白， 在520 nm分別測定吸光度值。

2.2.3 多糖量的計算 多糖量 （%） = （總糖量 -還原糖量） ×100%。

2.2.4 多糖提取率的計算 多糖提取率 （%） = （多糖量 ×提取液體積/茅蒼術總質量） ×100%。

2.3 響應面試驗設計 通過文獻 ［9-11］ 和預試驗， 得出影響茅蒼術多糖提取的主要因素有：纖維素酶加量、酶解溫度、酶解時間、液料比。根據中心組合設計原理，設計了4因素3水平， 其因素水平的編碼見表 1。

表1 響應面因素水平編碼

3 結果與分析

3.2 響應曲面分析與提取工藝優化 響應值 Y對應自變量X作出響應面圖和等高線，考察擬合響應面的形狀，反映出它們在提取過程中的相互作用及對茅蒼術多糖提取率的影響。 圖 1 為在酶解時間 90min 和液料比 20mL/g條件下，酶加量與酶解溫度對提取率影響的響應面圖和等高線圖。圖 2 為在酶加量 0.3%與酶解時間 90 min 條件下， 酶解溫度與液料比對提取率影響的響應面圖和等高線圖。利用二次多項式數學模型，可以得出最佳工藝條件為：纖維素酶酶加量 0.32%、 酶解溫度 52.51 ℃、 酶解時間92.21 min、液料比 22.73 mL/g， 可獲得茅蒼術多糖提取率的預測值為 36.14%。

表2 響應面分析試驗設計與結果

圖1 酶加量和酶解溫度對多糖提取率影響的響應面和等高線圖

圖2 酶解溫度和液料比對多糖提取率影響的響應面和等高線圖

3.3 模型驗證 考慮到實際情況， 將上述提取工藝參數修正為： 纖維素酶酶加量 0.32%、 酶解溫度 53 ℃、 酶解時間 92 m in、 液料比 23 ∶1。 為了驗證模型的可靠性， 在此條件下做 3 次平行試驗， 茅蒼術多糖提取率為 （35.78 ± 0.25）%， 結果表明實際測量值與預測值較接近， 說明該模型是合理有效。

4 討論

中藥材中植物藥占 90%， 植物藥的有效成分大多包裹在細胞壁中，而植物的細胞壁是由纖維素、半纖維素、果膠質、木質素等物質構成的致密結構。在提取藥用植物有效成分過程中，有效成分向提取介質擴散時，必須克服細胞壁及細胞間質的雙重阻力。選用適當的酶作用于藥用植物材料，可以通過酶反應溫和地分解細胞壁及細胞間質中的纖維素、半纖維素、果膠質等成分，破壞細胞壁的致密構造，引起細胞壁及細胞間質結構產生局部疏松、膨脹、崩潰等變化，減小細胞壁及細胞間質等傳質屏障對有效成分從胞內向提取介質擴散的傳質阻力，從而有利于有效成分的溶出［12-14］。 茅蒼術 根莖細 胞壁富含纖 維素， 利用纖維素酶處理，可改變細胞壁的通透性，有利于壁內的多糖成分溶出，大大的提高了多糖成分的提取率。

酶法用于中藥提取，可利用相關的酶制劑代替有機溶劑提高提取物的極性，縮短提取時間，保持有效成分藥效能提高有效成分的提取率，且操作簡便，對設備要求不高，條件溫和［15］。 因此， 酶法提取是一項很有前途的新技術，具有較大的應用潛力。

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R284.2

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： 1001-1528（2014）05-1088-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.049

2013-03-10

凡軍民 （1977—） ， 女， 博士， 副教授， 從事生物制藥的教學和研究工作。 Tel： 13305298969， Email： junminfan77@163.com