茄子絨菌斑病病原菌鑒定及生物學(xué)特性研究

劉志恒， 鄭 川， 黃欣陽(yáng)， 唐爽爽， 李健冰， 焦 俊

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866；2.遼寧省沈陽(yáng)市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，沈陽(yáng) 110034）

茄子絨菌斑病病原菌鑒定及生物學(xué)特性研究

劉志恒1*， 鄭 川1， 黃欣陽(yáng)2， 唐爽爽1， 李健冰1， 焦 俊1

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866；2.遼寧省沈陽(yáng)市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，沈陽(yáng) 110034）

摘要本文針對(duì)遼寧省近年茄子設(shè)施栽培生產(chǎn)上趨重發(fā)生的葉部病害——絨菌斑病，對(duì)該病的病原菌進(jìn)行了鑒定及其生物學(xué)特性研究。通過(guò)病原菌形態(tài)學(xué)鑒定，柯赫氏法則證病，并對(duì)病菌經(jīng)r DNA-ITS測(cè)序，鑒定該病致病菌為真菌灰毛茄釘孢［Passalora nattrassii（Deighton）U.Braun＆Crous］。病菌生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果表明：病菌菌絲生長(zhǎng)以PDA＋茄葉煎汁培養(yǎng)基為最適；適宜菌絲生長(zhǎng)的碳源和氮源分別為可溶性淀粉和胰蛋白胨；適宜溫度為25℃；最適p H為6；黑暗條件下菌絲生長(zhǎng)較好；菌絲致死溫度為59℃，10min。病菌分生孢子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果表明，茄葉汁能明顯促進(jìn)其萌發(fā)，碳源以麥芽糖、氮源以硫酸銨最適于孢子萌發(fā)，孢子萌發(fā)的適宜溫度為30℃；最適p H為5；光暗交替條件下萌發(fā)情況較好；分生孢子致死溫度為57℃，10min。

關(guān)鍵詞茄子絨菌斑病； 灰毛茄釘孢； 鑒定； rDNA-ITS測(cè)序； 生物學(xué)特性

茄子（Solanum melongena Linn.）是世界設(shè)施蔬菜栽培的重要作物之一。我國(guó)茄子生產(chǎn)在全世界栽培面積最大，總產(chǎn)量最高；其中設(shè)施栽培面積約100余萬(wàn)hm2。在遼寧，茄子是設(shè)施栽培中廣泛種植的主要蔬菜作物，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近10余年來(lái)，茄子絨菌斑病在遼寧省茄子生產(chǎn)上日趨嚴(yán)重，造成大批葉片枯死，植株早衰，嚴(yán)重影響產(chǎn)量。

茄子絨菌斑病是由真菌灰毛茄釘孢（Passalora nattrassii）引起的病害。早在1859年，Nattrass于肯尼亞的黃水茄上首次發(fā)現(xiàn)茄子葉霉病［1］。在我國(guó)，最早于1932年在廣東省記載了茄子葉霉病的發(fā)生，其后在四川（1941年）、山西（1943年）、內(nèi)蒙古（1944年）、河南（1959年）、臺(tái)灣（1959年）等省區(qū)相繼報(bào)道了該病危害［1］。歷史上，相關(guān)專(zhuān)家將其病原菌鑒定為真菌黃褐孢［Fulvia fulva（Cooke）Cif.］，與番茄葉霉病病菌相同［1-2］。2006年李龍生等認(rèn)為，在我國(guó)發(fā)生的茄子葉霉病應(yīng)稱(chēng)為茄子絨菌斑病，并將其病原菌訂正為灰毛茄菌絨孢（Mycovellosiella nattrassii Deighton）［3］。

迄今，有關(guān)茄子絨菌斑病的發(fā)生危害和病害防治的研究報(bào)道較多，而對(duì)于病菌生物學(xué)特性的系統(tǒng)研究少見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本文對(duì)遼寧省茄子絨菌斑病的病原菌進(jìn)行了鑒定，并經(jīng)柯赫氏法則進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)病菌r DNA-ITS測(cè)序，鑒定明確了茄子絨菌斑病的致病菌為真菌灰毛茄釘孢（Passalora nattrassii）。并進(jìn)一步對(duì)該病病原菌生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，以期為病害的深入研究及實(shí)踐防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試病害葉片標(biāo)樣采自遼寧省8個(gè)市區(qū)設(shè)施栽培茄子，按常規(guī)組織分離方法，分離病菌，經(jīng)純化獲得純培養(yǎng)。

1.2 病害癥狀描述

根據(jù)茄子絨菌斑病田間危害癥狀特點(diǎn)進(jìn)行描述記載。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 病原菌形態(tài)特征觀察

刮取病原菌，顯微觀察，并參考《中國(guó)真菌志》［4］及《The genera of hyphomycetes》［5］描述其形態(tài)特征。同時(shí)隨機(jī)測(cè)量1 000個(gè)分生孢子大小及分生孢子梗的尺度，計(jì)測(cè)自然生長(zhǎng)的病菌分生孢子單胞、雙胞、3胞及以上各類(lèi)孢子所占比例。

將純化的病菌單孢菌株移植于PDA平板，25℃恒溫箱培養(yǎng)，觀察其菌落顏色、形狀以及菌絲疏密程度。產(chǎn)孢后隨機(jī)測(cè)量1 000個(gè)分生孢子大小及分生孢子梗的尺度，計(jì)測(cè)人工培養(yǎng)條件下病菌分生孢子的單胞、雙胞、3胞及以上各類(lèi)孢子所占比例，并與自然生長(zhǎng)的病菌孢子進(jìn)行比較。

1.3.2 柯赫氏法則證病

供試茄子品種為‘西安綠茄’，選用其苗期6～8片真葉的植株進(jìn)行致病性測(cè)定。病菌接種設(shè)3種處理：無(wú)傷接種、針刺接種和孢子懸浮液（無(wú)菌水配制濃度為1×107個(gè)／m L）接種。以清水接種為對(duì)照。每處理3次重復(fù)，每次重復(fù)5個(gè)葉片。在26～28℃，相對(duì)濕度85%的條件下保濕培養(yǎng)。觀察并記錄接菌植株發(fā)病情況。

1.3.3 病原菌r DNA-ITS序列分析

采用天根新型植物基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA。采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對(duì)病原菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

反應(yīng)體系25.0μL：10×PCR buffer 2.5μL，MgCl22.0μL，d NTP 1.5μL，Taq酶（5U／L）0.2μL，ITS1（10μmol／L）2.0μL，ITS4（10μmol／L）2.0μL，模板DNA 2.0μL，dd H2O 12.8μL。擴(kuò)增所用試劑DL2000、dNTPs、Taq酶購(gòu)于TaKaRa。

r DNA-ITS基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，51℃退火40 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min，最后于4℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

1.4 生物學(xué)特性測(cè)定

1.4.1 不同條件對(duì)病菌菌絲及產(chǎn)孢量的影響

培養(yǎng)基的影響 供試培養(yǎng)基9種：PDA、PSA、OM、SNA、PDA＋茄葉煎汁［6］、PDA＋茄果煎汁、PDA＋番茄葉煎汁、查氏和V8汁。將病菌單孢移入上述培養(yǎng)基平板中央，25℃恒溫培養(yǎng)。40 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，利用紐鮑爾（Neubauer）血球計(jì)數(shù)板測(cè)定產(chǎn)孢量。進(jìn)行方差分析和多重比較。每處理5次重復(fù)。

碳源的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別將蔗糖等量替換淀粉、葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、果糖和乳糖6種不同碳源。病菌移植方法、菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量測(cè)量方法同上，25℃恒溫培養(yǎng)。每處理5次重復(fù)。

氮源的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別將KNO3等量替換蛋白胨、干酪素、牛肉膏、胰蛋白胨、脲、硫酸銨和氯化銨7種不同氮源。病菌移植方法、菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量測(cè)量方法同上，25℃恒溫培養(yǎng)。每處理5次重復(fù)。

溫度的影響 將病菌單孢移入PDA培養(yǎng)基平板中央，分別置于4、10、15、20、25、30和35℃7個(gè)不同溫度下恒溫培養(yǎng)。每處理5次重復(fù)。菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量測(cè)量方法同上。

p H的影響 采用PDA培養(yǎng)基，用HCl（1 mol／L）和NaOH（1 mol／L）將其p H分別調(diào)節(jié)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0計(jì)9個(gè)梯度。病菌移植方法、菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量測(cè)量方法同上，25℃恒溫培養(yǎng)。每處理5次重復(fù)。

光照的影響 設(shè)置24 h／d光照、（12 h光照與12 h黑暗）／d光暗交替、24 h／d黑暗3種處理?xiàng)l件，將病菌單孢移入PDA培養(yǎng)基平板中央，25℃恒溫培養(yǎng)。每處理5次重復(fù)。菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量測(cè)量方法同上。

菌絲致死溫度測(cè)定 將直徑5 mm的菌片置于裝有10 m L無(wú)菌水的試管中，將試管置于40～60℃（間隔梯度5℃）恒溫水浴鍋中處理10 min（預(yù)熱1 min），測(cè)得致死溫度范圍后，間隔1℃設(shè)置梯度，重復(fù)上述操作，確定最終致死溫度。每處理5次重復(fù)。

1.4.2 病菌分生孢子萌發(fā)條件測(cè)定

不同培養(yǎng)液的影響 供試培養(yǎng)液3種：25%的茄葉汁、番茄葉汁和辣椒葉汁，將分生孢子配成濃度為10～20個(gè)／視野（10×40倍顯微鏡）孢懸液。采用凹載片萌發(fā)法，以無(wú)菌水作對(duì)照。經(jīng)預(yù)備試驗(yàn)后，確定于30℃恒溫保濕培養(yǎng)，24 h后測(cè)定孢子萌發(fā)率。每處理重復(fù)5次，每次隨機(jī)計(jì)測(cè)100個(gè)孢子。

碳源的影響 供試培養(yǎng)液8種：1%淀粉、甘露醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨酸、乳糖和麥芽糖溶液，置于30℃條件下保濕培養(yǎng)。24 h后測(cè)定孢子萌發(fā)率，方法同上。

氮源的影響 供試培養(yǎng)液8種：1%硝酸鉀、氯化銨、硫酸鉀、脲、甲硫氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和谷氨酸溶液，置于30℃條件下保濕培養(yǎng)。24 h后測(cè)定孢子萌發(fā)率，方法同上。

溫度的影響 將分生孢子懸浮液分別置于4、10、15、20、25、30和35℃不同溫度下恒溫培養(yǎng)。24 h后測(cè)定孢子萌發(fā)率，方法同上。

p H的影響 用HCl（1 mol／L）和NaOH（1 mol／L）將分生孢子懸浮液p H調(diào)配為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0共9個(gè)梯度，30℃恒溫培養(yǎng)。24 h后鏡檢孢子萌發(fā)率，方法同上。

光照的影響 將分生孢子懸浮液滴在載玻片上，分別置于24 h／d光照、24 h／d黑暗條件以及12 h／d光照12 h／d黑暗3種光照條件下培養(yǎng)。24 h后測(cè)定孢子萌發(fā)率，方法同上。

分生孢子致死溫度測(cè)定 無(wú)菌水配制孢懸液裝入試管中（5 m L／管），將試管置于35～60℃（梯度為5℃）恒溫水浴鍋中處理10 min（預(yù)熱1 min左右），采用凹載片萌發(fā)法進(jìn)行孢子萌發(fā)測(cè)定，30℃條件下保濕培養(yǎng)，24 h后測(cè)定孢子萌發(fā)率。測(cè)得致死溫度范圍后，以1℃為梯度求得準(zhǔn)確的致死溫度。

1.4.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

運(yùn)用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（SSR法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀描述

通過(guò)田間調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在茄子旺盛結(jié)果期，棚內(nèi)處于高溫高濕條件下，茄子絨菌斑病的發(fā)生率顯著增加；幼苗期病害發(fā)生率較低。近年來(lái)，該病害的發(fā)生呈上升趨勢(shì)。

茄子絨菌斑病主要侵染葉片。發(fā)病初期，葉片正面出現(xiàn)黃色褪綠斑點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)展形成黃色、近圓形至不規(guī)則形病斑，病斑直徑一般為3～10 mm，病斑周緣具有黃色暈圈。濕度大時(shí)，病斑背面產(chǎn)生白色至灰白色霉?fàn)钗铮浜竺箤宇伾饾u加深，變成黃褐色，最后成棕褐色、深褐色甚至墨綠色。條件適宜時(shí)，葉片正面也可產(chǎn)生霉層。嚴(yán)重時(shí)病葉逐漸變黃脫落（圖1）。

圖1 茄子絨菌斑病田間發(fā)病癥狀Fig.1 Field symptoms on eggplant leaves caused by Passalora nattrassii

2.2 病原菌鑒定結(jié)果

2.2.1 病原菌形態(tài)特征

在茄子寄主上自然生長(zhǎng)的病菌，菌絲淡褐色，分隔明顯。分生孢子梗褐色或深褐色，不分支或偶爾分支，直或微彎，光滑，孢子梗一側(cè)有節(jié)狀膨大。分生孢子鏈生并具支鏈，長(zhǎng)橢圓形或短圓柱形，褐色至深褐色，表面光滑，0～7個(gè)隔膜，（8～82）μm×（2～11）μm（圖2a，2b）。經(jīng)分離純化后人工單孢移植培養(yǎng)的病菌，菌落生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)速度僅為1 mm／d左右。該病菌孢子在培養(yǎng)皿內(nèi)易于散播，形成多個(gè)大小不等的菌落。病菌在PDA培養(yǎng)基上于25℃單孢培養(yǎng)30 d后，培養(yǎng)基上出現(xiàn)直徑為25～25.5 mm的圓形深綠色菌落，初期菌落正面為深綠色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，菌落中間產(chǎn)生白色次生菌絲（圖2c）。

圖2 茄子絨菌斑病病原菌形態(tài)Fig.2 The shape of Passalora nattrassii

病菌在茄子寄主上自然生長(zhǎng)條件和PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)相比較，分生孢子大小和細(xì)胞數(shù)目及其比例大致相近，不同細(xì)胞數(shù)目孢子的比例均以2、3、4胞者為多，三者比例占90%左右；相對(duì)而言，人工培養(yǎng)條件下，分生孢子大小和細(xì)胞數(shù)略小于自然寄主上的測(cè)量值（表1）。

表1 茄子絨菌斑病病菌在自然寄主和培養(yǎng)基上孢子細(xì)胞數(shù)目和大小比較Table 1 Comparison of spore cell number and size of Passalora nattrassii on the host and the media

2.2.2 柯赫氏法則證病結(jié)果

經(jīng)3種方法接種處理后，均引致了茄子植株發(fā)病，而清水對(duì)照未發(fā)病。接種20 d后葉片正面出現(xiàn)黃色褪綠斑點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)展形成黃色、不規(guī)則形病斑，癥狀表現(xiàn)與田間癥狀一致。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，針刺接種較其他2種接種方法發(fā)病顯癥快。取接種發(fā)病葉片再次分離，獲得了與原接種菌株相同的病原菌。證實(shí)了該菌為茄子絨菌斑病的致病菌。

2.2.3 病原菌r DNA-ITS序列分析結(jié)果

利用引物對(duì)ITS1／ITS4對(duì)菌株r DNA-ITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出一條519 bp的片段（圖3a）。將測(cè)序結(jié)果上傳到NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。該菌與GenBank中已登錄AB531500灰毛茄釘孢菌（Passalora nattrassii）序列相似性達(dá)到99%。鑒定該菌為灰毛茄釘孢菌［P.nattrassii（Deighton）U.Braun＆Crous］。

2.3 環(huán)境條件對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響

2.3.1 培養(yǎng)基的影響

由圖4可以看出，病菌菌絲在PDA＋茄葉煎汁培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快，其次為燕麥培養(yǎng)基，在PDA＋番茄葉煎汁培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度最慢。從菌落形態(tài)和顏色看，菌絲在燕麥、查氏和SNA培養(yǎng)基上相對(duì)稀薄，在PDA＋茄葉煎汁、PDA＋茄果煎汁、PDA和PSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，菌絲稠密且孢子形態(tài)較接近寄主上的孢子形態(tài)。該病菌在不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量存在一定差異，其中在PDA＋茄葉煎汁、PDA＋茄果煎汁和V8汁植物源的培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量較多，而在燕麥和SNA培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量較少。

圖3 病原菌的ITS序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR products of Passalora nattrassii DNA

圖4 不同培養(yǎng)基對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響Fig.4 Effects of different media on mycelium growth and sporulation of P.nattrassii

2.3.2 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

病菌可以利用多種形式的碳源，在可溶性淀粉中菌絲生長(zhǎng)最快，形成的菌落平輔，菌絲層薄；其次為甘露醇；在乳糖中生長(zhǎng)最慢，僅為5.2 mm。此外在以淀粉為碳源的培養(yǎng)基上病菌產(chǎn)孢量最大，在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基中，病菌不產(chǎn)孢（圖5）。

2.3.3 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

病菌可以利用無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源，有機(jī)氮源更有利于菌絲擴(kuò)展。在胰蛋白胨中菌絲生長(zhǎng)最快，在氯化銨中菌絲生長(zhǎng)最慢；病菌在以胰蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量最大，其次為蛋白胨，在氯化銨中產(chǎn)孢量最小。但從供試7種氮源整體利用趨勢(shì)看，菌絲生長(zhǎng)速度與產(chǎn)孢量沒(méi)有正相關(guān)性（圖6）。

圖5 不同碳源對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響Fig.5 Effect of different carbohydrate on mycelium growth and sporulation of P.nattrassii

圖6 不同氮源對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響Fig.6 Effects of different nitrogen sources on mycelium growth and sporulation of P.nattrassii

2.3.4 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

圖7試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量影響顯著，菌絲在10～25℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，最適宜溫度為25℃。低于4℃或高于30℃病菌菌絲均不生長(zhǎng)。病菌隨著溫度的升高在25℃時(shí)產(chǎn)孢量達(dá)到最大，低于4℃或高于30℃均不產(chǎn)孢。

圖7 不同溫度對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響Fig.7 Effects of different temperatures on mycelium growth and sporulation of P.nattrassii

2.3.5 p H對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

圖8試驗(yàn)結(jié)果表明，病菌菌絲在p H范圍為3～11之間均可生長(zhǎng)，最適p H為6；病菌在p H范圍為3～10之間均可產(chǎn)孢，當(dāng)p H為6時(shí)產(chǎn)孢量最大，說(shuō)明偏酸性的條件有利于病菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢。

圖8 不同p H對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響Fig.8 Effects of different p H values on mycelium growth and sporulation of P.nattrassii

2.3.6 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，菌絲生長(zhǎng)對(duì)光照條件要求不高，在持續(xù)光照、黑暗、光暗交替條件下生長(zhǎng)差異不大，在黑暗條件下菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢情況較好。

2.3.7 菌絲致死溫度測(cè)定

測(cè)定結(jié)果表明，當(dāng)處理溫度達(dá)59℃時(shí)，菌絲停止生長(zhǎng)，由此確定該菌菌絲致死溫度為59℃，10 min。

2.4 環(huán)境條件對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

2.4.1 不同培養(yǎng)液的影響

圖9 不同培養(yǎng)液對(duì)病菌分生孢子萌發(fā)的影響Fig.9 Effects of different media on spore germination of P.nattrassii

由圖9可以看出，3種不同培養(yǎng)液對(duì)病菌分生孢子的萌發(fā)都有一定的促進(jìn)作用，其中茄葉汁培養(yǎng)液能夠有效地促進(jìn)孢子萌發(fā)，分生孢子的萌發(fā)率最高為55.4%。芽糖中孢子的萌發(fā)率最高，可達(dá)到40.17%；其次為葡萄糖、可溶性淀粉；在果糖、乳糖和甘露醇中萌發(fā)率較低，都低于10%，說(shuō)明雙糖有利于病菌分生孢子的萌發(fā)（圖10）。

圖10 不同碳源對(duì)病菌分生孢子萌發(fā)的影響Fig.10 Effects of different carbohydrate sources on spore germination of P.nattrassii

2.4.3 氮源的影響

病菌分生孢子可以在多種氮源中萌發(fā)，在硫酸銨中孢子的萌發(fā)率最高，可達(dá)到65.55%，其次為丙氨酸，分生孢子的萌發(fā)率為11.18%，在其他5種氮源中萌發(fā)率偏低，都低于5%。這與偏酸性的條件有利于病菌分生孢子的萌發(fā)的研究結(jié)論相吻合（圖11）。

圖11 不同氮源對(duì)病菌分生孢子萌發(fā)的影響Fig.11 Effects of different nitrogen sources on spore germination of P.nattrassii

2.4.4 溫度的影響

圖12試驗(yàn)結(jié)果表明，溫度對(duì)病菌分生孢子萌發(fā)具有較大影響，30℃為萌發(fā)最適溫度，萌發(fā)率為51.59%，在4～30℃之間，孢子萌發(fā)率隨著溫度的升高而增高；在30～35℃之間孢子萌發(fā)率隨著溫度的升高而降低。

圖12 不同溫度對(duì)病菌分生孢子萌發(fā)的影響Fig.12 Effects of different temperatures on spore germination of P.nattrassii

2.4.5 p H的影響

由圖13可以看出，病菌分生孢子在p H范圍為3～11之間均可萌發(fā)，最適p H為5，分生孢子的萌發(fā)率可達(dá)到54.05%。說(shuō)明偏酸性的條件有利于病菌分生孢子的萌發(fā)。

圖13 不同p H對(duì)病菌分生孢子萌發(fā)的影響Fig.13 Effects of different p H values on spore germination of P.nattrassii

2.4.6 光照的影響

光照對(duì)于病菌分生孢子萌發(fā)的影響較小，在光暗交替條件下，分生孢子萌發(fā)率較高，可達(dá)到10.36%；在黑暗條件下萌發(fā)率相對(duì)較低，僅為4.7%。表明該菌分生孢子萌發(fā)能力較弱。

2.4.7 分生孢子致死溫度測(cè)定

測(cè)定結(jié)果表明，當(dāng)處理溫度≥57℃時(shí)，病菌分生孢子均不萌發(fā)，由此確定該菌分生孢子致死溫度為57℃，10 min。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定、柯赫氏法則證病及ITS測(cè)序，最終鑒定明確遼寧省茄子絨菌斑病的致病菌為灰毛茄釘孢菌［Passalora nattrassii（Deighton）U.Braun＆Crous］。

查閱文獻(xiàn)，有關(guān)茄子絨菌斑病致病菌的歸屬曾有過(guò)一定變動(dòng)。1972年Deighton對(duì)發(fā)生在日本高知縣的茄子絨菌斑病病原菌做出鑒定，認(rèn)為是由菌絨孢屬（Mycovellosiella）引起的病害。在我國(guó)，有專(zhuān)家認(rèn)為該病病菌為黃褐孢［Fulvia fulva（Cook）Cif.］，與番茄葉霉病病菌相同［1-2］。2006年李龍生等對(duì)發(fā)生在我國(guó)的茄子葉霉病菌作出訂正，認(rèn)為病原菌應(yīng)為灰毛茄菌絨孢（Mycovellosiella nattrassii Deighton）。本研究采集我國(guó)遼寧省茄子栽培地茄子絨菌斑病病原菌，經(jīng)常規(guī)組織分離獲得病菌純培養(yǎng)，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定、柯赫氏法則證病及ITS測(cè)序，并參考《中國(guó)真菌志》及《The genera of hyphomycetes》的相關(guān)描述，最終將該致病菌鑒定為灰毛茄釘孢菌（P.nattrassii）。

生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，該菌最適生長(zhǎng)溫度為30℃，最適碳源為淀粉，最適氮源為胰蛋白胨，最適p H為6，光照條件對(duì)病菌生長(zhǎng)影響較小，病原菌菌絲致死溫度為59℃、10 min。該菌分生孢子萌發(fā)的最適條件為30℃、1%麥芽糖、1%硫酸銨、最適p H為5。病原菌分生孢子致死溫度為57℃、10 min。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，該病菌菌落生長(zhǎng)緩慢，經(jīng)單孢移植培養(yǎng)，菌絲生長(zhǎng)速度僅為1 mm／d左右，結(jié)果與報(bào)道的飛機(jī)草菌絨孢菌［6］及番茄葉霉病菌［7］菌絲生長(zhǎng)速度相似。

試驗(yàn)還表明，病菌分生孢子萌發(fā)需要時(shí)間較長(zhǎng)（24 h萌發(fā)率最高為65.55%，48 h萌發(fā)率達(dá)到100%），但產(chǎn)孢量非常大，故適宜條件下病菌擴(kuò)散蔓延較快，短時(shí)間即可對(duì)溫室茄子生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。在茄汁培養(yǎng)液中能夠有效促進(jìn)病菌孢子萌發(fā)，茄子葉片加入培養(yǎng)基中能夠促進(jìn)病菌的生長(zhǎng)與繁殖，由此說(shuō)明原寄生的營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)病菌生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用。

灰毛茄釘孢菌的適宜生長(zhǎng)范圍在10～25℃，最適溫度25℃，分生孢子萌發(fā)最適溫度為30℃，這與溫室高溫高濕有利于病害迅速傳播蔓延和危害發(fā)展有著直接關(guān)系。該病菌能夠利用多種碳源和氮源進(jìn)行生長(zhǎng)與繁殖，所有供試碳源、氮源除乳糖外均能滿足該菌生長(zhǎng)的需要，但是菌絲生長(zhǎng)、分生孢子萌發(fā)對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的需求存在一定差異，并且菌絲生長(zhǎng)速度與其產(chǎn)孢能力無(wú)正相關(guān)關(guān)系，最有利于病原菌生長(zhǎng)的碳源為可溶性淀粉，最佳供試氮源為胰蛋白胨；最有利于孢子萌發(fā)的碳源為麥芽糖，最佳供試氮源為硫酸銨。菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)對(duì)于酸堿度的要求較為一致，在偏酸性條件下生長(zhǎng)和萌發(fā)情況較好，說(shuō)明偏酸性的條件利于該病的發(fā)生與危害。病菌菌絲的致死溫度為59℃、10 min，分生孢子致死溫度為57℃、10 min。由此認(rèn)為，該病菌可能具有很強(qiáng)的耐熱能力，是一種抗逆性很強(qiáng)的病菌。

本研究結(jié)果明確了茄子絨菌斑病的致病菌，為研究該病害流行規(guī)律及病害防治提供了一定的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］ 李明遠(yuǎn)，嚴(yán)紅，張濤濤，等.遼寧發(fā)現(xiàn)茄子葉霉病［J］.植物保護(hù)，1997，23（6）：45-46.

［2］ 劉永.茄子葉霉病綜合防治技術(shù)［J］.植保技術(shù)與推廣，2001，21（10）：17.

［3］ 李龍生，李寶聚，朱輝，等.中國(guó)茄子絨菌斑病病原菌的訂正［J］.菌物學(xué)報(bào)，2006，25（3）：505-508.

［4］ 郭英蘭，劉錫琎.中國(guó)真菌志（第二十卷）［M］.北京：科學(xué)出版社，2003.

［5］ Keith S，Gareth M J，Walter G，et al.The genera of hyphomycetes［M］.The Netherlands：CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre：2011：145-147，303－304，331－332.

［6］ 郭光遠(yuǎn)，楊宇容，馬俊，等.飛機(jī)草菌絨孢菌生物學(xué)性狀研究［J］.生物防治通報(bào)，1992，8（3）：120-124.

［7］ 顧沛雯，張軍翔，徐紅敏.番茄葉霉病菌生物學(xué)特性研究［J］.寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，25（3）：21-23.

［8］ Yamaguchi J I，Inada M，Matsuzaki M.Environmental factors for release and dispersal of conidiospores of Mycovellosiella nattrassii Deighton，causal fungus of leaf mold of eggplant［J］.Annals of the Phytopathological Society of Japan，2000，66（1）：5-11.

［9］ Yamaguchi J I，Inada M，Matsuzaki M.Thermal death range of conidiospores of Mycovellosiella nattrassii Deighton，the casual fungus of leaf mold on eggplant［J］.Proceedings of the Association for Plant Protection of Kyushu，1999，45：27-29.

［10］Jamjan Meeboon，Iman Hidayat，Chaiwat To-anun.An annotated list of cercosporoid fungi in Northern Thailand［J］.Journal of Agricultural Technology，2007，3（1）：51-63.

中圖分類(lèi)號(hào)：S 436.411

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.010

收稿日期：2013-08-09

修訂日期：2013-12-16

*通信作者E-mail：lzhh1954＠163.com

Pathogen identification and biological characteristics of eggplant leaf mold

Liu Zhiheng1， Zheng Chuan1， Huang Xinyang2， Tang Shuangshuang1， Li Jianbing1， Jiao Jun1
（1.College of Plant Protection，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China；2.Shenyang Agricultural Technology Promotion Station，Liaoning 110034，China）

AbstractThe identification and biological characteristics of eggplant leaf mold caused by Passalora nattrassii was studied.Pathogen identification was conducted according to Koch’s postulates，morphology and molecular method. The results showed that the pathogen of eggplant leaf mold was Passalora nattrassii.The biological characteristics test showed that the optimal temperature for growth was 25℃and the optimal p H was 7.The best medium was PDA added with boiled leaf juice of eggplant.The mycelia grew best in soluble starch as carbon source and in peptone as nitrogen source.The mycelia grew better in darkness，and the lethal temperature was 59℃for 10min. The fresh leaf juice of eggplant could significantly promote the rate of conidia germination.The optimal temperature for conidia germination was 30℃and the optimal p H was 5.The conidia germinated best in maltose as carbon source and in ammonium sulfate as nitrogen source.The conidia germinated better under conditions of alternating light and dark，and the lethal temperature was 57℃for 10min.

Key wordseggplant leaf mold； Passalora nattrassii； pathogen identification； r DNA-ITS； biological characteristics