三七主要病原菌對皂苷的敏感性分析

楊 敏， 梅馨月， 鄭建芬， 尹兆波， 趙 芝， 張瀟丹， 何霞紅， 朱書生

（云南農業大學農業生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室，昆明 650201）

三七主要病原菌對皂苷的敏感性分析

楊 敏， 梅馨月， 鄭建芬， 尹兆波， 趙 芝， 張瀟丹， 何霞紅， 朱書生*

（云南農業大學農業生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室，昆明 650201）

摘要采用菌絲生長速率法測定了三七4種病原菌對三七皂苷粗提物及其含有的4種主要皂苷的敏感性。結果表明，三七皂苷粗提物對病原菌的抑制活性較低，在濃度1 000μg／m L條件下對4種供試病原菌的抑制率均低于20%。在低濃度下對銹腐病菌和惡疫霉菌甚至表現出明顯的促生作用。利用HPLC分析表明，三七皂苷粗提物中含有R1、Rb1、Rg1和Rd4種主要皂苷。在濃度為1 000μg／m L條件下，R1、Rb1和Rg1對銹腐病菌均表現明顯的促進生長作用；Rg1對惡疫霉D-1菌株表現出微弱的抑制作用，而R1、Rb1、Rd對惡疫霉菌均具有較低的促生長活性；R1和Rb1對腐皮鐮刀菌PN-21具有較弱的促生長作用，而Rg1和Rd具有較弱的抑制作用；4種皂苷對侵染三七莖部的人參鏈格孢菌均具有抑菌活性，抑菌能力Rd＞Rb1＞R1＞Rg1，Rd的抑制率可達23.43%。本試驗結果表明，三七一些皂苷可以促進根腐病菌的生長，對根腐病的發生具有促進作用。

關鍵詞三七； 根腐病菌； 人參皂苷； 敏感性

三七［Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen］為五加科人參屬多年生草本植物。三七性喜溫暖陰濕，其獨特的生態環境導致根腐病發生嚴重。三七根腐病可由多種病原菌侵染所致，其病原菌主要包括柱孢屬真菌（Cylindrocarpon destructans、C. didynum）、茄腐鐮刀菌（Fusarium solani）及其根生?；停‵usarium solani f.sp.radicicola）、惡疫霉（Phytophthora cactorum）、莖點霉（Phoma herbarum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、槭刺孢［Mycocentrospora acerina（Hartig）Deighton］、假單胞菌（Pseudomonas spp.）和根結線蟲（Meloidogyne spp.）等［1-5］。根腐病的發生已經嚴重制約了三七的生產。

皂苷是三七主要的次生代謝產物。迄今已從三七的不同部位分離得到三十多種單體皂苷成分。這些單體皂苷大多數為達瑪烷型的20（S）-原人參二醇型和20（S）-原人參三醇型［6］。皂苷是植物固有的一類天然抗菌化合物，在植物抵御病原菌的侵染中具有重要作用［7］，而且一些皂苷能以根系分泌物的形式釋放到根際土壤中［8］。根系分泌物是植物根系產生并向根際分泌的化合物，包括糖、蛋白質、氨基酸及其他次生代謝產物等［9］，在植物根與病原菌間的互作中扮演著非常重要的角色［10］。一方面，土壤中病原物通過感應根系分泌的化學信號完成對寄主的識別和定殖［11］；另一方面，植物根系分泌出的次生代謝物質可以抵御病原物的侵染，例如，常見作物番茄、豌豆、麥類、玉米和辣椒等根系分泌物中就含有具抑菌活性的酚類、黃酮類及其他化合物［12-13］。皂苷在三七抵御病原菌特別是根腐病菌侵染或在病原菌識別寄主過程中的作用均還未知。本試驗以3種三七根腐病菌及黑斑病菌為研究對象，測定這些病原菌對三七皂苷粗提物及主要皂苷的敏感性，為深入研究三七與根腐病菌之間的化感互作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物材料

健康的三年生三七塊根，于2012年10月采自云南省文山市硯山縣苗鄉三七有限公司盤龍鎮種植基地。

1.1.2 供試菌株

供試茄腐鐮刀菌、惡疫霉菌、銹腐病菌、人參鏈格孢菌均由云南農業大學農業生物多樣性與病害控制實驗室分離自三七病樣，且經過鑒定的致病菌（表1）。

表1 供試病原菌Table 1 The isolates tested

1.1.3 供試培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖18 g，瓊脂16 g，去離子水定容至1 L，用于腐皮鐮孢菌、銹腐病菌和人參鏈格孢菌的培養；胡蘿卜培養基（CA）：胡蘿卜200 g，組織搗碎機搗碎后4層紗布過濾；瓊脂粉16 g，去離子水定容至1 L，用于惡疫霉菌的培養。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的培養

將上述供試菌株在培養基上活化3～4次后，取生長較旺盛的菌株備用。

1.2.2 供試病原菌對三七皂苷粗提物的敏感性測定

1.2.2.1 三七粗皂苷的提取

方法參照Nicol等［8］的方法進行并稍作調整。取三年生三七根2 g，40℃烘干48 h后研磨成粉，將三七粉均分成5份，分別置于50 m L離心管中，用10 m L 80%甲醇超聲提取40 min（30℃）后離心（12 000 r／min，4℃，5 min），收集上清液，下層粉末再重復提取2次，離心后合并3次上清液，將所有上清液用旋轉蒸發儀蒸發至干（40℃），稱重，再用一定量甲醇溶解，使三七粗皂苷的濃度為500 mg／m L，0.45μm濾膜過濾除菌，將濾液置于－20℃冰箱中保存備用。

1.2.2.2 三七粗皂苷對病原菌的抑制作用測定

分別將三七粗皂苷用甲醇稀釋至105、104、103、102μg／m L的溶液。取母液及上述4個濃度的三七粗皂苷提取液0.8 m L置于無菌三角瓶中，再加入冷卻至40℃的滅菌培養基定容至80 m L，充分混勻后配制成5個不同濃度的培養基平板。每一濃度設置4次重復。將供試病原菌在培養基上培養5 d后，用直徑為0.5 cm的打孔器沿菌落邊緣打取菌餅。將供試菌餅接種于培養基平板中央，以培養基中混入1%甲醇的平板為對照，置于25℃恒溫培養箱中培養。

1.2.3 三七粗皂苷中主要皂苷成分HPLC檢測

稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd標準品（購于上海同田生物技術有限公司）各0.01 g，加入一定量甲醇溶解配制成每1 m L分別含0.2 mg的標準品溶液，所得標準品溶液用0.45μm濾膜過濾。三七塊根提取液按照1.2.2.1的方法提取，提取液過濾后檢測。檢測條件如下：色譜柱（Kinetex 2.6μm C18 100A 50 mmⅹ4.6 mm美國Phenomennex）；流動相由乙腈（A）和0.05%H3PO4水（B）組成，0～21 min用22%A和78%B洗脫，21～31 min用33%A和67%B洗脫，22～42 min用22%A和78%B洗脫；流速：1.0 m L／min；波長：203 nm；柱溫：室溫；進樣體積：10μL［14］。

1.2.4 三七中主要皂苷的抑菌活性測定

稱取人參皂苷Rg1、Rb1、Rd和三七皂苷R1各0.1 g，加入1.0 mL甲醇配制成100 mg／m L的母液；其次，用移液槍移取上述皂苷單體各0.8 mL置于無菌三角瓶中，再加入冷卻至40℃的滅菌培養基定容至80 mL充分混勻后配制成濃度為1 000μg／mL的培養基平板。將惡疫霉菌D-1、茄腐鐮刀菌PN-21、銹腐病菌CD-MS-7和人參鏈格孢菌A1在培養基上培養5 d后，用直徑為0.5 cm的打孔器沿菌落邊緣打取菌餅。將供試菌餅接種于培養基平板中央，以培養基中混入1%甲醇的平板為對照，置于25℃恒溫培養箱中培養，每一處理設置4次重復。

1.2.5 數據統計

培養5 d后，待空白對照菌落長到培養皿的2／3左右，用“十字交叉法”測量出每一處理下的菌落生長直徑，求出各平均值帶入公式計算。

2 結果與分析

2.1 供試病原菌對三七粗皂苷提取液的敏感性

2.1.1 茄腐鐮刀菌對三七粗皂苷的敏感性

供試的8株茄腐鐮刀菌菌株對三七粗皂苷的敏感性存在差異（圖1）。但在濃度1、10和100μg／m L條件下，提取液對多數菌株的抑制率均低于10%，隨提取液濃度升高，抑制作用增強。當濃度為5 000μg／m L時，抑制效果多在20%～30%之間，個別菌株也僅能達到35%左右。

2.1.2 銹腐病菌對三七粗皂苷的敏感性

粗皂苷提取液在濃度1和10μg／mL時對供試的3株銹腐病菌均表現出促進生長作用，濃度100μg／ mL時對CD-MS-8和CD-MS-9菌株也表現促生長作用，而對CD-MS-7表現出微弱的抑制作用；只有當供試濃度達到1 000μg／m L或以上時，對3株供試菌株僅表現較弱的抑制作用，即使在供濃度5 000μg／m L時，抑制率也僅在25%左右（圖2）。

圖1 茄腐鐮刀菌對三七粗皂苷的敏感性Fig.1 The sensitivity of Fusarium solani isolates to the crude saponin extracts of P.notoginseng

圖2 銹腐病菌對三七粗皂苷的敏感性Fig.2 The sensitivity of Cylindrocarpon destructans isolates to the crude saponin extracts of P.notoginseng

2.1.3 惡疫霉菌對三七粗皂苷的敏感性

由圖3可以看出，三七粗皂苷提取液在濃度1μg／m L和10μg／m L條件下抑制率較低，甚至促進部分菌株的生長。當供試濃度達到100μg／m L時，對除菌株D-12之外的所有菌株均表現出微弱的抑制作用；當濃度升高到1 000μg／m L時，抑制作用增強到20%～30%，在供試最高濃度5000μg／m L時，敏感菌株的最高抑制率達50%～60%。

圖3 惡疫霉菌對三七粗皂苷的敏感性Fig.3 The sensitivity of Phytophthora cactorum isolates to the crude saponin extracts of P.notoginseng

2.1.4 人參鏈格孢菌對三七粗皂苷的敏感性

由圖4可以看出，三七粗皂苷提取液在低濃度下（1、10μg／m L）抑制率較低，甚至促進某些菌株的生長，當供試濃度達到100μg／m L時，對除菌株A5之外的所有菌株均表現出抑制作用；當濃度升高到1 000μg／m L時，抑制作用增強到10%～30%，在供試最高濃度5 000μg／m L時，敏感菌株的最高抑制率可達30%～40%。

2.2 三七病原菌對三七中主要皂苷的敏感性

2.2.1 三七塊根提取液中皂苷成分檢測結果

利用HPLC結合標準品的方法分析了三七塊根提取液中含有的主要皂苷成分（圖5），結果表明，從三七塊根提取液中可檢測出4種主要的皂苷成分，即R1、Rg1、Rb1和Rd。

圖4 人參鏈格孢菌對三七粗皂苷提取液的敏感性Fig.4 The sensitivity of Alternaria panax isolates to the crude saponin extracts of P.notoginseng

圖5 三七塊根提取液中主要皂苷的HPLC檢測Fig.5 The main ginsenosides in the crude saponin extracts of P.notoginseng detected by the method of HPLC

2.2.2 供試病原菌對三七主要皂苷的敏感性

試驗結果表明（表2），R1、Rb1和Rg1在供試濃度1 000μg／m L條件下，均可明顯促進銹腐病菌CDMS-7菌株菌絲生長，Rd對CD-MS-7無顯著影響。Rg1對惡疫霉D-1菌株表現出微弱的抑制作用，而R1、Rb1、Rd對惡疫霉菌均具有較低的促生長活性。R1和Rb1對腐皮鐮刀菌PN-21具有較弱的促生長作用，而Rg1和Rd具有較弱的抑制作用。供試4種皂苷對人參鏈格孢菌均具有抑菌活性，抑菌能力Rd＞Rb1＞R1＞Rg1。

表2 4種皂苷單體在濃度1 000μg／m L條件下對三七主要病原菌的抑菌活性1）Table 2 Antifungal activity of four ginsenosides to the pathogens of P.notogensing at the concentration of 1 000μg／mL

3 結論與討論

本試驗的結果表明，不同病原菌對三七粗皂苷的敏感性具有差異。皂苷粗提液在低濃度下對供試的4種病原菌均具有較明顯的促生作用，只有當濃度上升到1 000μg／m L或以上時，才對供試病原菌表現一定的抑菌活性，但抑菌活性菌株之間存在差異，其原因可能與不同菌株之間對三七的致病性差異有關。孫玉琴等的研究也表明三七水培液、三七鮮根水提液、三七總皂苷對毀壞柱孢菌和腐皮鐮刀菌的生長均有促進作用［15］。Nicol等對與三七同科的西洋參研究也顯示，西洋參皂苷粗提物對非病原菌木霉菌（Trichoderma spp.）和葉部病原菌人參鏈格孢菌（A.panax）具有明顯的抑菌活性，而對根部病原菌C.destructans、P.cactorum和Py.irregulare具有促進生長的作用［16］。供試病原菌對三七粗皂苷提取液中的幾種主要皂苷成分的敏感性也有差異。在1 000μg／m L條件下，R1、Rb1、Rg1和Rd對銹腐病菌均表現明顯的促進生長作用；Rg1和Rd對鐮刀菌和惡疫霉菌具有較弱的抑制作用。但4種皂苷對三七莖部病原菌人參鏈格孢菌具有一定的抑制作用，Rd還表現出較強的抑菌活性。比較三七粗皂苷和4個皂苷單體對三七病原菌的抑菌活性差異結果表明，在濃度1 000μg／m L條件下，三七粗皂苷對供試病原菌的抑制效果明顯強于4個皂苷單體。這可能與不同皂苷之間存在協同增效作用或者在所提取的三七粗皂苷中還含有其他具有抑菌活性的次生代謝產物，如槲皮素等黃酮類物質［6］有關，但還有待試驗進一步證實。

皂苷是五加科植物主要的次生代謝產物。有研究表明，人參皂苷可能還是西洋參受到病原真菌侵染后產生的一類重要防御物質。西洋參植株體內的人參皂苷Rb1含量在接種茄腐鐮刀菌和尖孢鐮刀菌后迅速上升，且Rb1在40mg／mL濃度條件下對茄腐鐮刀菌和尖孢鐮刀菌的孢子萌發抑制率分別為25%和42%［17］。但本研究中供試皂苷Rb1在濃度1 000μg／m L對茄腐鐮刀菌不但沒有抑菌活性，反而能促進病原菌的生長，這可能與試驗所使用的濃度有關，也可能與不同菌株之間的致病性差異有關。供試的4種皂苷中除了Rg1對惡疫霉及Rg1和Rd對茄腐鐮刀菌菌株表現出微弱的抑制作用外，其他皂苷對3種根部病原菌均表現出促進生長作用。這種促生作用可能與病原菌對這些物質的解毒代謝有關。皂苷酶是病原菌產生的能水解植物皂苷的葡萄糖苷酶，通常能解毒或降解皂苷。很多病原菌產生皂苷酶，其中一些酶具有寄主特異性。例如，麥類全蝕病菌（G.graminis var.avenae）能產生一種胞外燕麥皂苷酶，這種酶能將燕麥產生的植保素avenacin A-1降解［17-19］。將產生這種酶的基因突變后菌株就不能侵染含有皂苷的寄主［7］。從西洋參病株上分離的畸雌腐霉菌也能產生皂苷酶降解20（S）-原人參二醇型皂苷，而從豆科植物上分離的畸雌腐霉菌降解能力卻很弱［20］。供試部分皂苷對三七根部病原菌不但無抑制活性，反而能促進其生長。這表明三七根腐病菌在與三七長期協同進化過程中不僅形成了對皂苷的解毒機制，而且還可能形成了利用皂苷的特殊機制。

綜上所述，土壤是一個復雜的集合體，根腐病的發生可能源于不同因素如自毒物質、微生物等的相互作用，最終導致植物生長受阻。三七分泌到根際的一些皂苷對根腐病菌的生長具有促進作用，這會導致三七植株選擇性地吸引根腐病菌在根際定殖和擴繁，這可能是導致三七根腐病發生嚴重的重要原因。另外，三七連作障礙的形成也可能是由于土壤中存在的皂苷類物質能提供根腐病菌生存的營養，導致根腐病菌在土壤中長期存活。但這些推測均需進一步試驗驗證。

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中圖分類號：S 435.672

文獻標識碼：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.014

收稿日期：2013-08-07

修訂日期：2013-11-19

基金項目：云南省發展與改革委員會專項（高技20112513）；國家自然科學基金（31260447）

*通信作者E-mail：shushengzhu79＠126.com

Sensitivity of the pathogens of Panax notoginseng to ginsenosides

Yang Min， Mei Xinyue， Zheng Jianfen， Yin Zhaobo， Zhao Zhi， Zhang Xiaodan， He Xiahong， Zhu Shusheng
（Key Laboratory of Agricultural Biodiversity for Plant Disease Management，Ministry of Education，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China）

AbstractThe sensitivity of the main pathogens of Panax notoginseng to the crude saponin extract from cultivated P.notoginseng and four ginsenosides was evaluated using the mycelial growth method.The results indicated that the pathogen exhibited a low sensitivity to crude saponin extract.The inhibition ratios of mycelial growth by all pathogens tested were all lower than 20%at the concentration of 1 000μg／m L.The mycelial growth of Phytophthora cactorum and Cylindrocarpon destructans was stimulated when the concentration of crude saponin extract was lower than 100μg／m L.The ginsenosides，including R1，Rb1，Rg1and Rd，were identified via HPLC in the crude saponin extract.The mycelial growth of C.destructans was strongly stimulated by these four ginsenosides at the concentration of 1 000μg／m L.The mycelial growth of P.cactorum was slightly inhibited by Rg1，but slightly promoted by R1，Rb1and Rd.The mycelial growth of Fusarium solani was slightly inhibited by Rg1and Rd，but slightly promoted by R1and Rb1.In contrast，growth of the leaf pathogen Alternaria panax was inhibited by these four ginsenosides（Rd＞Rb1＞R1＞Rg1）.The inhibition ratio of Rdeven reached to 23.43%.These results imply that ginsenosides can act as allelopathic stimulators for the growth of soilborne pathogens in the rhizosphere，and this may contribute to the occurrence of root rot of P.notoginseng.

Key wordsPanax notoginseng； root rot； ginsenosides； sensitivity