血清GP73和AFP等十項腫瘤標志物聯合診斷HBsAg陽性肝癌的研究

董飛波 高國生 徐曉珍 祝成亮 顏衛華

●論 著

血清GP73和AFP等十項腫瘤標志物聯合診斷HBsAg陽性肝癌的研究

董飛波 高國生 徐曉珍 祝成亮 顏衛華

目的 探討血清高爾基體蛋白73（GP73）及甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、鐵蛋白（SF）、糖基抗原（CA19-9、CA15-3、CA125）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰基轉肽酶（GGT）、亮氨酸氨基轉肽酶（LAP）等腫瘤標志物單項和聯合檢測對乙型肝炎（乙肝）病毒表面抗原（HBsAg）陽性肝癌的診斷價值。方法收集85例慢性乙肝、74例乙肝肝硬化、133例HBsAg陽性肝癌患者及46例健康體檢者的血清，對GP73及AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP等腫瘤標志物進行檢測，并對檢測結果進行統計學分析。結果Spearman相關分析表明血清GP73與AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP均有一定的相關性（均P＜0．05），除CA125外，肝癌組的相關系數均比非肝癌組小；但只有GP73與AFP、GGT及LAP的相關性在兩組間的差異有統計學意義（均P＜0．05）。GP73、AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP在慢性乙肝組、乙肝肝硬化組、肝癌組和正常對照組中的差異均有統計學意義（均P＜0．05），肝癌組的GP73、AFP、LAP的血清水平均顯著高于其他組（均P＜0．05）。ROC曲線分析表明，單項指標中以GP73的ROC曲線下面積最大（AUC=0．792）,但與AFP和ALP的差異不大（Z=0．127、1．908，P=0．899、0．056）。通過logistic回歸對上述指標構建新的預測模型，聯合預測因子（PRE）的AUC顯著高于其它單項指標（均P＜0．05）。結論GP73單項檢測有較好的診斷作用，GP73聯合AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP檢測可提高對HBsAg陽性肝癌的診斷效能。

原發性肝癌 高爾基體蛋白73 甲胎蛋白 ROC曲線

近年來，高爾基體蛋白73（GP73）被認為是最值得期待的血清標志物之一，有多篇文獻報道GP73對診斷肝癌方面有較好的價值[1-3]，但GP73聯合其它血清學標志物對肝癌，特別是國內以乙型肝炎（乙肝）為基礎的肝癌的診斷研究報道較少。本研究通過檢測血清GP73及甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、鐵蛋白（SF）、糖基抗原（CA19-9、CA15-3、CA125）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰基轉肽酶（GGT）、亮氨酸氨基轉肽酶（LAP）等常用腫瘤標志物在不同類型乙肝相關疾病中的表達情況，探討其單項和聯合檢測對HBsAg陽性肝癌的診斷價值，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2010-01—2013-05在寧波市第二醫院住院的患者血清標本292例，其中慢性乙肝患者85例，男67例，女18例，年齡20～75歲，平均（38.99± 11.62）歲；乙肝肝硬化患者74例，男49例，女25例，年齡33～81歲，平均（54.88±11.04）歲；肝癌患者133例，男120例，女13例，年齡33～85歲，平均（55.14±10.74）歲。所有患者均有HBV感染的病因學基礎（HBsAg陽性），同時排除其他肝炎病毒感染。對肝癌患者進行臨床分期，其中Ⅰ期35例，Ⅱ期35例，Ⅲ期63例。所有患者的診斷標準、肝癌臨床分期標準均符合中華醫學會制定的《慢性乙型肝炎防治指南》[4]及第4屆全國肝癌學術大會討論通過的原發性肝癌診斷標準[5]，且肝癌患者均未行手術、介入、化療、分子靶向治療。另選取同期健康體檢者46例作為正常對照組，其中男35例，女11例，年齡18～77歲，平均（33.37±12.92）歲。本研究經醫院倫理委員會批準，所有對象均簽署知情同意書。

1.2 方法 受檢者均采集清晨空腹靜脈血5ml，分離后的血清于-20℃冰箱保存待測。GP73測定采用酶聯免疫吸附試驗（定量）檢測，試劑盒由北京熱景生物技術有限公司提供；AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125檢測采用微粒子酶免疫分析技術，儀器為美國ABBOTT AXSYM全自動免疫分析儀，原裝試劑盒；ALP、GGT采用AU2700全自動生化分析儀檢測，原裝試劑盒；LAP采用AU2700全自動生化分析儀檢測，試劑盒由長春匯力生物技術有限公司提供。

1.3 統計學處理 應用SPSS16.0統計軟件。血清GP73、AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP檢測結果經過正態性檢驗呈偏態分布，采用中位數（四分位數）表示；多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較采用Nemenyi法。雙變量間相關性采用Spearman相關分析。繪制ROC曲線并采用ROC曲線下面積（AUC）評價血清GP73和AFP對肝癌的診斷價值。多因素logistic回歸分析的引入標準為P＜0.05，剔除標準為P＞0.10，方法為Backward:wald；logistic回歸構建新的預測模型參照文獻[6]。AUC和相關系數的比較運用正態性Z檢驗。

2 結果

2.1 血清GP73與9種腫瘤標志物的相關性分析 根據患者是否患肝癌分為非肝癌組和肝癌組，對血清GP73及AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP進行Spearman相關分析，結果表明兩組中血清GP73與其它腫瘤標志物均有相關性（均P＜0.05）。除CA125外，肝癌組的相關系數均比非肝癌組小，但只有GP73與AFP、GGT及LAP的相關性在兩組間的差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表1、圖1。

表1 血清GP73與9種腫瘤標志物的相關性分析

2.2 血清GP73與9種腫瘤標志物檢測結果的比較 GP73、AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、 GGT、LAP在慢性乙肝組、乙肝肝硬化組、肝癌組和正常對照組中的差異均有統計學意義（均P＜0.05），其中肝癌組的GP73、AFP、LAP水平均顯著高于其他組（均P＜0.05），詳見表2。

圖1 血清GP73與AFP在非肝癌組和肝癌組中的相關性

2.3 血清GP73和9種腫瘤標志物單項及聯合檢測診斷肝癌的ROC曲線分析 以正常人及良性肝病患者作為對照組，對GP73和其它9種腫瘤標志物進行多因素logistic回歸分析構建新的預測模型，并得到聯合預測因子（PRE），PRE=CA15-3+0.1447GP73+0.0263AFP+ 0.1447LAP。利用ROC曲線分析各腫瘤標志物及聯合預測因子對肝癌的診斷效能，結果發現單項指標中，以GP73的ROC曲線下面積最大（AUC=0.792），但與AFP和ALP的差異無統計學意義（Z=0.127、1.908，P＞0.05）；而PRE的AUC顯著高于其它所有單項指標（均P＜0.05），詳見表3、4、圖2。

表2 血清GP73與9種血清學標志物檢測結果的比較

表3 GP73與9種腫瘤標志物logistic回歸分析結果

2.4 血清GP73和其它9種腫瘤標志物單項對良性肝病的ROC曲線分析 （1）以正常人和乙肝肝硬化及肝癌患者作為對照組，利用ROC曲線分析各腫瘤標志物對慢性乙肝的診斷效能，所有單項指標（包括GP73）AUC＜0.600（GP73、AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP的AUC分別為0.373、0.347、0.338、0.570、0.472、0.268、0.255、0.374、0.560、0.550）。（2）以正常人和慢性乙肝及肝癌患者作為對照組，利用ROC曲線分析各腫瘤標志物對乙肝肝硬化的診斷效能，單項指標僅CEA和CA125的AUC＞0.700（AUC=0.719、0.734），其余指標（包括GP73）的AUC均＜0.600。

表4 GP73與其它9種腫瘤標志物及聯合預測因子診斷肝癌的AUC

2.5 血清GP73與9種腫瘤標志物與肝癌臨床分期的關系 所有腫瘤標志物的血清水平均隨著肝癌臨床分期的增加而逐步升高；經Kruskal-Wallis H檢驗，除CEA外的其余指標均有統計學意義（均P＜0.05）。

圖2 GP73、其它9種腫瘤標志物及聯合預測因子診斷肝癌的ROC曲線

3 討論

肝癌的診斷，特別是早期診斷一直是臨床研究的熱點和難點。作為目前最有效、最常用的標志物，AFP雖應用于臨床數十年，但其敏感性僅40%～65%，特異性僅76%～96%。GP73的發現似乎為這一難題的解決提供了契機，但國內外的研究結論并不完全一致。Marrero等[1]、Riener等[7]及國內的Mao等[3]、Hu等[8]均認為GP73比AFP更有效，但Morota等[9]和楊穎等[10]則認為GP73和AFP的診斷價值相當（其AUC分別為0.78和0.81）。由此，GP73和AFP及其它腫瘤標志物的聯合檢測可能有更好的診斷價值[3，7，11]。

本研究結果表明，血清GP73與AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP均有一定的相關性（均P＜0.05），但除CA125外，肝癌組比非肝癌組的相關性要差，這提示GP73與其它腫瘤標志物存在互補的可能，且慢性乙肝組、乙肝肝硬化組、肝癌組血清GP73與其它9種腫瘤標志物水平均高于正常對照組，特別是肝癌組的GP73、AFP、LAP的血清水平均顯著高于其他組（均P＜0.05）。因此，如將GP73與AFP、LAP等腫瘤標志物聯合檢測，則有可能提高診斷效能。

聯合診斷試驗一般有兩種方法，即平行（或稱并聯）試驗和系列（或稱串聯）試驗，兩者無法同時提高敏感性和特異性。其中平行試驗，即一系列試驗中任何一試驗呈陽性其結果即判為陽性，提高了敏感性（至少是相等），卻降低了特異性；而系列試驗，即一系列試驗中所有試驗均為陽性其結果才判為陽性，提高了特異性（至少是相等），卻降低了敏感性。但是通過多因素logistic回歸分析構建新的預測模型，可以有效解決上述問題[6]。ROC曲線分析結果表明，單項指標中，以GP73的診斷價值最好（AUC=0.792），但與AFP和ALP的差異不大，這與Morota等[9]和楊穎等[10]的觀點一致；而聯合預測因子的AUC顯著高于其它所有單項指標（均P＜0.05），證明聯合檢測確實可以提高肝癌的診斷效能。

總之，GP73單項檢測對HBsAg陽性肝癌有較好的診斷價值，GP73聯合AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP檢測可有效提高對肝癌的診斷效能。由于本文所選擇的病例有限，在異質性、研究人群、測試設備或方法等方面難免存在偏倚，更確切的結論還需要多中心、大樣本的實驗數據對其進行支持。

[1]Marrero J A,Romano P R,Nikoheva O,et al．GP73,a resident Golgi glycoprotein,is a novel serum marker for hepatocellular carcinoma [J]．J Hepatol,2005,43(6)：1007-1012．

[2]Giannelli G,Antonaci S．New frontiers in biomarkers for hepatocellular carcinoma[J]．Dig Liver Dis,2006,38(11)：854-859．

[3]Mao Y,Yang H,Xu H,et al．Golgi protein 73(GOLPH2)is a valuable serum marker for hepatocellular carcinoma[J]．Gut,2010,59(12)：1687-1693．

[4]中華醫學會肝病學分會、感染病學分會．慢性乙型肝炎防治指南[J]．中華肝臟病雜志,2005,13(12)：881-891．

[5]中國抗癌協會肝癌專業委員會．原發性肝癌診斷標準[J]．中華肝臟病雜志,2000,8(3)：135．

[6]高國生,馮家飛,丁世雄．甲胎蛋白、銅藍蛋白和觸珠蛋白聯合診斷原發性肝癌評價[J]．中國衛生檢驗雜志,2011,21(12)：2833-2834．

[7] Riener M O,Stenner F,Liewen H,et al．Golgi phosphoprotein 2 (GOLPH2)expression in liver tumors and its value as a serum marker in hepatocellular carcinoma[J]．Hepatology,2009,49(5)：1602-1609．

[8]Hu J S,Wu D W,Liang S,et al．GP73,a resident Golgi glycoprotein, is sensibility and specificity for hepatocellular carcinoma of diagnosis in a hepatitis B-endemic Asian population[J]．Med Oncol, 2010,27(2)：339-345．

[9]Morota K,Nakagawa M,Sekiya R,et al．A comparative evaluation of Golgi protein-73,fucosylated hemopexin,alpha-fetoprotein,and PIVKA-II in the serum of patients with chronic hepatitis,cirrhosis, and hepatocellular carcinoma[J]．Clin Chem Lab Med,2011,49(4)：711-718．

[10]楊穎,肖蕾,毛睿,等．高爾基體糖蛋白73的表達特征及其對肝癌與肝硬化的鑒別診斷價值[J]．中華肝臟病雜志,2012,20(12)：920-924．

[11]Tian L,Wang Y,Xu D,et al．Serological AFP/golgi protein 73 could be a new diagnostic parameter of hepatic diseases[J]．Int J Cancer,2010,129(8)：1923-1931．

Single detection of Golgi protein 73 and combined with other serum tumor markers in diagnosis of HBsAg-positive hepatocellular car-cinoma

Objective To evaluate single detection of Golgi protein 73(GP73)or combined with other serum tumor markers in diagnosis of HBSAg-positive hepatocellular carcinoma(HCC)．MethodsSerum samples were collected from 133 cases of HBsAg-positive HCC,85 cases of chronic hepatitis B (CHB),74 cases of liver cirrhosis(LC)infected with HBV and 46 healthy subjects．Serum levels of GP73,AFP,CEA,SF,CA19-9,CA15-3,CA125,ALP,GGT and LAP were assayed and the results were analyzed．ResultsSpearman correlation analysis showed that levels of serum GP73 was associated with the levels of AFP,CEA, SF,CA19-9,CA15-3,CA125,ALP,GGT and LAP(P＜0．05),not with CA125;the correlation coefficient of AFP,GGT and LAP in HCC group were lower than that in non-HCC group(P＜0．05)．There were significant differences in serum levels of GP73,AFP, CEA,SF,CA19-9,CA15-3,CA125,ALP,GGT and LAP between CHB,LC,HCC patients and normal controls(P＜0．05)．The serum levels of GP73,AFP and LAP in HCC group were significantly higher than those in other groups(P＜0．05)．ROC curve analysis showed that there was no significant difference in area under ROC among GP73,AFP and ALP (Z=0．127 and 1．908 respectively,P=0．899 and 0．056 respectively),although the AUC of GP73 was the largest(AUC=0．792）．By logistic regression,we used all these indicators to build a new prediction model．The results showed that the AUC of the combined markers was significantly higher than any single markers(P＜0．05)．ConclusionGP73 is a high sensitive and specific serum mark for diagnosis of PHC and the detection of GP73 combined with AFP,CEA,SF,CA19-9,CA15-3,CA125,ALP,GGT and LAP can improve the diag-nostic value for HBsAg-positive HCC patients．

Hepatocellular carcinoma Golgi protein 73 Alpha fetoprotein ROC curve

2013-07-05）

（本文編輯：嚴瑋雯）

國家自然科學基金（81101485）；天晴肝病研究基金（TQGB20120081）；浙江省醫藥衛生一般研究計劃（2011KYB107）

325035 溫州醫科大學檢驗醫學院、生命科學學院（董飛波，現在在寧波市第二醫院檢驗科工作）；溫州醫科大學附屬臺州醫院中心實驗室（顏衛華）；寧波市第二醫院檢驗科（高國生），肝病二科（徐曉珍）；武漢大學人民醫院檢驗科（祝成亮）

顏衛華，E-mail:yanwh@tzhospital.com