白芍總苷對內毒素性心肌炎大鼠心肌組織炎癥因子的影響

蔣旭宏 華軍益 潘智敏 何煜舟 葉武 毛威 阮善明 丁黎敏 黃兆銓

白芍總苷對內毒素性心肌炎大鼠心肌組織炎癥因子的影響

蔣旭宏 華軍益 潘智敏 何煜舟 葉武 毛威 阮善明 丁黎敏 黃兆銓

目的 研究白芍總苷（TGP）對內毒素性心肌炎大鼠心肌組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、NF-κB表達的影響。方法通過尾靜脈注入脂多糖（LPS）建立內毒素性心肌炎大鼠模型，分別以低、中、高劑量的TGP進行干預，光鏡觀察大鼠心肌組織的病理學變化，免疫組化檢測心肌組織TNF-α、IL-1β、NF-κB的表達水平。結果光鏡觀察發現模型組大鼠心肌組織炎癥反應明顯，較多炎癥細胞浸潤；TGP中、高劑量組大鼠心肌組織炎癥反應較輕，有少量炎癥細胞浸潤；低劑量組大鼠心肌組織炎癥壞死程度介于模型組和中劑量組之間。免疫組化檢測提示TGP中、高劑量組TNF-α、IL-1β、NF-κB的表達明顯減少，與模型組比較均有統計學差異（均P＜0．01）；TGP低劑量組的TNF-α、IL-1β表達與模型組均無統計學差異（均P＞0．05），而NF-κB的表達與模型組有統計學差異（P＜0．05）。結論TGP能有效抑制內毒素性心肌炎大鼠心肌組織炎癥反應，減輕心肌損傷，在中、高劑量時效果明顯。

白芍總苷 內毒素血癥 心肌炎 TNF-α IL-1β NF-κB

嚴重感染、創傷、休克、手術等致病因素常常并發內毒素血癥，誘發全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），甚至多器官衰竭，進而嚴重威脅患者生命。心肌損傷是內毒素血癥的常見并發癥，發生率約為50%，內毒素血癥患者出現心功能障礙大約占40%，一旦發生心臟并發癥，患者病死率即由20%上升到70%～90%[1]。因此，如何有效預防和治療內毒素血癥患者的心肌損傷變得至關重要，但目前臨床尚無有效治療內毒素血癥性心肌炎的方法。筆者既往研究發現，中藥白芍的提取物白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）對內毒素性心肌炎的炎癥反應有抑制作用，本研究擬進一步觀察TGP對心肌組織中TNF-α、IL-1β、NF-κB的蛋白表達水平的影響，以闡明TGP防治內毒素性心肌炎的作用機制，為進一步開發利用浙江道地藥材白芍提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑 清潔級雄性Wistar大鼠50只由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供，體重（200±20）g。脂多糖（LPS）購自美國Sigma公司，TGP（批號：H20055058）購自寧波立華制藥有限公司，TNF-α、IL-1β、NF-κB p65抗體均購自美國Santa Cruz公司，DAB顯色劑、免疫組化二步法試劑盒、濃縮型DAB試劑盒（ZLI-9032）為北京中杉金橋公司產品。

1.2 方法 50只Wistar大鼠在實驗室分籠飼養1周，室溫維持25℃，自由進食、飲水。以隨機數字表法將大鼠分為5組（每組各10只）：（1）空白組：以0.9%氯化鈉溶液4ml灌胃，1次/8h，共3次。（2）模型組：在10min內通過尾靜脈注射LPS 5mg/kg，再予0.9%氯化鈉溶液4ml灌胃，1次/8h，共3次。（3）TGP低劑量組：在10min內通過尾靜脈注入LPS 5mg/kg，再將TGP 100mg/（kg· d）溶于0.9%氯化鈉溶液12ml中，取4ml灌胃，1次/8h，共3次。（4）TGP中劑量組：在10min內通過尾靜脈注入LPS 5mg/kg，再將TGP 200mg/（kg·d）溶于0.9%氯化鈉溶液12ml中，取4ml灌胃，1次/8h，共3次。（5）TGP高劑量組：在10min內通過尾靜脈注入LPS 5mg/kg，再將TGP 300mg/（kg·d）溶于0.9%氯化鈉溶液12ml中，取4ml灌胃，1次/8h，共3次。所有大鼠末次給藥后禁食、自由飲水12h，以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后予處死，收集心肌組織，制片待測。

1.3 心肌組織TNF-α、IL-1β、NF-κB的表達檢測 采用免疫組化二步法，具體操作按試劑盒說明書進行，400倍光鏡下采集圖像，陽性染色為深棕黃色。計分標準：每張切片隨機選取5個高倍視野，根據著色程度及著色細胞陽性范圍進行計算。著色程度：0分，不著色；1分，著色淡；2分，中等著色；3分，著色深。著色細胞陽性范圍：0分，無著色；1分，著色陽性細胞＜1/3；2分，著色陽性細胞1/3～1/2；3分，著色陽性細胞＞1/2。將著色程度與著色細胞陽性范圍得分各自相加為其最后計分，取平均數。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 心肌組織病理學觀察結果 HE染色后鏡下觀察提示，空白組大鼠心肌細胞的結構清晰，心肌纖維完整，未見壞死組織和炎癥細胞浸潤；模型組大鼠心肌細胞水腫明顯，結構模糊，部分壞死灶，心肌組織較多炎癥細胞浸潤；TGP中、高劑量組大鼠心肌細胞有輕度水腫，結構可分辨，有少量壞死灶，心肌組織少量炎癥細胞浸潤；TGP低劑量組大鼠心肌組織水腫程度和炎癥壞死程度介于模型組和中劑量組之間（圖1，見插頁）。

2.2 心肌組織中TNF-α、IL-1β、NF-κB的表達檢測免疫組化提示空白組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白有少量表達，模型組心肌組織細胞質、細胞核中TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白均有明顯表達，特別是細胞核中表達明顯，與空白組比較均有統計學差異（均P＜0.01）；TGP低劑量組TNF-α、IL-1β蛋白表達較高，與模型組比較均無統計學差異（均P＞0.05），而NF-κB蛋白表達與模型組比較有統計學差異（P＜0.05）；TGP中、高劑量組TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白表達均明顯少于模型組（均P＜0.01），見表1和圖2-4（見插頁）。

表1 各組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-1β、NF-κB的表達（分）

3 討論

內毒素血癥是嚴重感染、創傷和手術等引起急危重癥時常見并發癥[2]，體內的內毒素、TNF-α和IL-1β等水平明顯升高，TNF-α和IL-1β是發病過程中最重要的炎性介質，可引發“級聯”反應，導致炎性介質“瀑式”釋放，加劇機體的炎癥反應及組織器官的損傷，甚至導致多器官功能衰竭[3]。其中，心功能障礙是患者最嚴重的并發癥之一，病死率高，其病理機制往往與內毒素性心肌炎有關，炎癥因子被認為在此發病中占主導地位[4]。內毒素血癥可導致心肌細胞變性和壞死，激活內源性阿片系統，進而NF-κB信號轉導途徑，引起一系列的炎癥反應[5]。上調多種炎癥介質和細胞因子基因轉錄和表達，尤其是TNF-α、IL-1β等原發性炎癥介質的增加，NF-κB、TNF-α和IL-1β的釋放可進一步引起心肌細胞凋亡和心肌重構[6]，如何減輕內毒素性心肌炎的炎癥反應是防治的關鍵。

白芍（杭白芍）是浙江的道地藥材，著名的“浙八味”之一。白芍始載于《神農本草經》，據《明醫別錄》記載，白芍“通順血脈，緩中”可治“時行寒熱”，其味苦、酸、微寒、歸肝脾經。具有平肝鎮痛，養血調經，斂陰止汗功效[7]。杭白芍主要含有芍藥苷、芍藥內酯苷、羥基芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、苯甲酰羥基芍藥苷等苷類成分，從杭白芍中提取精制的TGP具有抗炎、免疫調節、抑制細胞凋亡、抗氧自由基等多種藥理作用[8]。筆者受《難經·十四難》“損其心者，調其營衛”理念的啟發，以“調扶營衛”為治療大法采用TGP干預內毒素性心肌炎大鼠，觀察心肌組織的炎癥因子TNF-α、IL-1β、NF-κB的含量變化，以此明確TGP對內毒素性心肌炎炎癥反應的抑制作用。

本研究通過尾靜脈注入LPS建立內毒素性心肌炎大鼠模型，用低、中、高劑量的TGP分別進行干預，發現模型組大鼠心肌組織炎癥反應明顯，心肌細胞明顯水腫，結構模糊，部分壞死灶，心肌組織較多炎癥細胞浸潤；TGP中劑量組和高劑量組大鼠心肌組織炎癥反應較輕，心肌細胞有輕度水腫，少量壞死灶，心肌組織有少量炎癥細胞浸潤；TGP低劑量組大鼠心肌組織炎癥壞死程度介于模型組和中劑量組之間。免疫組化檢測提示，TGP中、高劑量組TNF-α、IL-1β、NF-κB的表達明顯減少，與模型組比較有統計學差異，在中、高劑量組之間則差別不明顯；低劑量組TNF-α、IL-1β與模型組比較無統計學差異，而NF-κB的表達與模型組比較有統計學差異。

綜上所述，本研究發現TGP能有效抑制內毒素性心肌炎大鼠心肌組織炎癥反應，減輕心肌損傷，而且在中、高劑量時效果明顯，此結果可為臨床應用TGP防治內毒素性心肌炎提供實驗參考。

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[4] Magnani J W,Dec G W．Myocarditis current trends in diagnosis and treatment[J]．Circulation,2006,113(6)：876-890．

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[6] 梁英健,李鑫,張曉娟,等．NF-κB在膿毒癥血漿誘導的內皮細胞損傷和凋亡中的作用[J]．中國病理生理雜志,2013,29(8)：1508-1511．

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[8] 謝仲德,李文烈,方應權,等．白芍中芍藥苷的閃式提取工藝研究[J]．中成藥,2013,35(9)：2037-2039．

Effect of total glucosides of paeony on expression of inflammatory factors in myocardial tissue of rats with myocarditis induced by endotoxin

Objective To investigate whether total glucosides of paeony (TGP)could inhibit expression of inflammatory factors in myocardial tissue of rats with myocarditis．MethodsMyocarditis was induced by injection of endotoxin LPS through the tail vein in rats;then low,middle or high doses of TGP were administered by gastric perfusion respectively．Histopathological changes were examined by HE staining;the expression of TNF-α,IL-1βand NF-κB in myocardial tissue was detected by immunohistochemistry．ResultsHistopathology demonstrated marked inflammation in cardiac tissue with infiltration of inflammatory cells．TGP with middle and high dose alleviated inflammation in cardiac tissue．Expression of TNF-α,IL-1βand NF-κB was up-graded in rats with myocarditis,which was attenuated in middle and high dose-TGP groups(P＜0．01)．ConclusionTGP with middle or high dose can effectively inhibit inflammation in cardiac tissue of rats with endotoxin-induced myocarditis．

Total glucosides of paeony Endotoxemia Myocarditis TNF-α IL-1β NF-κB

2013-10-18）

（本文編輯：馬雯娜）

浙江省中醫藥科學研究基金項目（2011ZB047）；浙江省中醫藥科學研究基金項目（2011ZA034）

310006 杭州，浙江中醫藥大學附屬第一醫院心內科

華軍益，E-mail：huajunyi1973@163.com