食管鱗癌中MEKK3和NF-κB的表達及其臨床意義

殷憲剛 葛榮 周新成 陳金平 夏朝霞

食管鱗癌中MEKK3和NF-κB的表達及其臨床意義

殷憲剛 葛榮 周新成 陳金平 夏朝霞

目的 研究有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3（MEKK3）、核轉錄因子（NF-κB）蛋白在食管鱗癌組織中的表達及其臨床意義。方法收集76例食管鱗癌患者的癌組織及相應的35例癌旁異型增生組織和20例正常食管黏膜組織，應用免疫組化EnVision法檢測MEKK3、NF-κB蛋白的表達。結果食管鱗癌組織中MEKK3蛋白陽性表達率高于癌旁異型增生組織和正常食管黏膜組織（均P＜0．05）；NF-κB蛋白表達陽性率在正常食管黏膜組、癌旁異型增生組、食管鱗癌組中依次升高；MEKK3、NF-κB蛋白表達與臨床分期、浸潤深度及淋巴結轉移均相關（均P＜0．05），而與患者年齡、性別及組織學分級均無關（均P＞0．05）；MEKK3與NF-κB蛋白的陽性表達呈正相關（r=0．308，P＜0．05）。結論MEKK3、NF-κB蛋白異常表達與食管鱗癌的發生、浸潤轉移及預后相關，且兩者呈正相關。聯合檢測MEKK3和NF-κB蛋白表達可作為食管鱗癌的診斷、預后評估的參考依據。

有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3 核轉錄因子 食管鱗癌

近年來研究發現，細胞信號轉導異常與腫瘤的生物學行為密切相關。核轉錄因子（nuclear factor kappa B，NF-κB）具有多向調節作用，參與調控體內多種生理和病理過程。有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3（mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase kinase 3，MEKK3）是一種屬于MAP3K家族的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[1]。既往研究證實MEKK3與乳腺癌、卵巢癌、肝細胞癌等腫瘤的發生、發展密切相關，而MEKK3與NF-κB在食管鱗癌發生中的作用及其相互關系未見報道。本研究采用免疫組化EnVision法檢測食管鱗癌組織、癌旁異型增生組織和正常食管黏膜組織中MEKK3、NF-κB蛋白的表達，以探討MEKK3、NF-κB蛋白異常表達與食管鱗癌發生的關系及其臨床意義。

1 對象和方法

1.1 對象 選取本中心2011-06—2012-12食管癌手術切除標本76例，所有病例均經3位病理專家重復讀片證實為鱗狀細胞癌。癌旁組織距癌組織邊緣3cm以內，正常組織取自手術殘端，距癌組織3cm以上。以簡單隨機法從76例標本中選取相應的癌旁異型增生組織標本35例及相對正常的食管黏膜標本20例。患者中男45例，女31例；年齡41～81歲，平均（61.3±7.1）歲；組織學分級：高中分化49例，低分化27例；按UICC（1997）TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期47例，Ⅲ+Ⅳ期29例；浸潤深度：淺肌層浸潤26例，深肌層浸潤28例，漿膜層22例；有淋巴結轉移31例，無淋巴結轉移45例。所有組織標本均固定于4%多聚甲醛中并以石蠟包埋。

1.2 試劑 鼠抗人MEKK3單克隆抗體ab40756為英國Abcam公司產品；鼠抗人NF-κBp65單克隆抗體、EnVision試劑盒及DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法 采用免疫組化EnVision法檢測MEKK3、NF-κB蛋白的表達。參照試劑盒說明書進行操作，用已知的陽性對照片作為陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定 MEKK3以細胞質內出現棕黃色顆粒者為陽性表達；NF-κB陽性則主要表達于細胞核，呈現棕黃色顆粒。每一張切片隨機觀察10個高倍視野，每個視野計數100個細胞，共計數1 000個細胞，凡細胞內出現清晰棕黃色顆粒者為陽性細胞，以細胞無棕色或與背景一致的淡棕色為陰性細胞。切片內陽性細胞數＜10%判定為陰性，≥10%判定為陽性。

1.5 統計學處理 采用SPSS 11.0統計軟件，計數資料間比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析。

2 結果

2.1 MEKK3和NF-kB蛋白在食管鱗癌組織、癌旁異型增生組織和正常食管黏膜組織中的表達 MEKK3蛋白陽性率在正常食管黏膜組（15.0%）、癌旁異型增生組（44.4%）、食管鱗癌組（84.2%）中依次升高；NF-κB蛋白陽性率也在正常食管黏膜組（10.0%）、癌旁異型增生組（40.0%）、食管鱗癌組（72.4%）中依次升高，組間比較均有統計學差異（均P＜0.05）。食管鱗癌組織中MEKK3和NF-κB呈強陽性表達，見圖1-2。

2.2 MEKK3和NF-kB蛋白表達與食管鱗癌患者臨床病理特征的關系 MEKK3、NF-κB蛋白表達分別與食管鱗癌臨床分期、浸潤深度及淋巴結轉移相關（均P＜0.05）；而與患者性別、年齡及病理分級無關（均P＞0.05），見表1。

2.3 MEKK3和NF-κB蛋白在食管鱗癌中表達的相關性 在食管鱗癌組織中，MEKK3蛋白陽性率84.2%（64/ 76），NF-κB蛋白陽性率72.4%（55/76），兩者共同陽性率65.8%（50/76）。MEKK3和NF-κB蛋白在食管鱗癌組織中的表達呈正相關（r=0.308，P＜0.05）。

圖1 MEKK3在食管鱗癌組織中強陽性表達（EnVision法，× 400）

圖2 NF-κB在食管鱗癌組織中強陽性表達（EnVision法，× 400）

表1 MEKK3和NF-κB蛋白表達與食管鱗癌患者臨床病理特征的關系[例（%）]

3 討論

食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一，也是我國最常見的惡性腫瘤之一。50.0%的食管癌患者在發現時已有遠處轉移或已經無法進行手術切除，而其發病機制目前尚未完全清楚。因此，研究與食管癌發生、發展及預后相關的細胞信號轉導分子對診斷治療有重要意義。

細胞信號轉導異常與腫瘤的惡性生物學行為密切相關，因此腫瘤細胞異常的信號轉導已成為腫瘤研究的熱點之一[2]。既往研究發現，MAPK和NF-κB信號途徑的過度激活與腫瘤的發生、發展及浸潤轉移密切相關。NF-κB可調控多種細胞因子、生長因子基因的轉錄表達，參與細胞增殖和凋亡的調節，由此參與調控體內多種生理和病理過程。NF-κB異常活化能保護腫瘤細胞免于凋亡，并與腫瘤的發生、侵襲、轉移及耐藥相關[3]。MEKK3是一種屬于MAP3K家族的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[2]。該蛋白激酶通過激活包括JNK、p38、ERK5在內的MAPKs和NF-κB信號通路，調控早期胚胎心血管系統的發育、內皮細胞的增殖凋亡、肌細胞的形成并參與各種炎癥和免疫應答過程[4]。研究已證明MEKK3是脂多糖、TNF-α及IL-1介導的NF-κB激活的重要調控激酶[5]。MEKK3可激活NF-κB抑制物激酶（IKKs），后者可磷酸化NF-κB復合物中的抑制成分IκB使其激活。NF-κB與IκB結合處于非活化狀態，IκB磷酸化后可與NF-κB分離，導致NF-κB的持續活化，活化的NF-κB遷移至核內，在核內起轉錄因子的作用，可誘導眾多炎性相關的基因如TNF-α、IL-6和IL-8等的表達及調控相關癌基因的轉錄與表達[6]。研究發現，NF-κB過度激活與許多惡性腫瘤有關，如乳腺癌、卵巢癌、肝細胞癌[7]、肺癌等。Samanta等[8]發現乳腺癌和卵巢癌細胞過表達MEKK3蛋白可導致NF-κB活性增強，并與此兩種癌細胞持續抵抗凋亡密切相關；Chiao等[9]發現人肝癌Hep3B細胞中MEKK3的高表達可使Rel/NF-κB的活性增加，從而抑制了肝癌細胞的凋亡；Lin等[10]發現MEKK3及其下游信號分子ERK在肺腺癌A549細胞中異常激活與癌細胞的浸潤轉移密切相關。

本研究結果顯示，MEKK3在由正常食管黏膜組織、癌旁異型增生組織到食管鱗癌組織的演進過程中其蛋白陽性表達率依次升高，三者之間有統計學差異。提示MEKK3蛋白的高表達可能成為食管鱗癌發生的早期標志物，對于食管鱗癌的早期診斷有一定的臨床意義。進一步研究顯示，MEKK3蛋白表達與食管鱗癌臨床分期、腫瘤浸潤、轉移有關，而與患者性別，年齡及組織學分級無關，提示MEKK3可能參與食管鱗癌的浸潤轉移過程，并可能與患者的預后有關。而NF-κB蛋白陽性率在食管鱗癌組織高于癌旁異型增生組織及正常食管黏膜組織，也具有統計學差異。進一步研究顯示，NF-κB表達與食管鱗癌臨床分期、腫瘤轉移有關，而與患者性別，年齡、腫瘤大小及病理分型無關，表明NF-κB蛋白過表達參與了食管鱗癌的發生、浸潤與轉移。

此外，本研究還提示MEKK3和NF-κB蛋白在食管鱗癌組織中的表達呈正相關，表明兩者可能在食管鱗癌的發生和浸潤轉移過程中可能起到一定程度的協同作用。由此筆者推測MEKK3表達可能增強NF-κB信號傳導通路的活性，最終導致了腫瘤的發生。兩者聯合檢測對于腫瘤早期診斷、預后評價及闡明食管鱗癌的發生、發展機制具有重要臨床意義。

[1]Blank J L,Gerwins P,Elliott E M,et al．Molecular cloning of mitogen-activated protein/ERK kinase kinases(MEKK)2 and 3．Regulation of sequential phosphorylation pathways involving mitogen-activated protein kinase and c-Jun kinase[J]．J Biol Chem, 1996,271(10)：5361-5368．

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[3] Li W,Tan D,Zenali M J,et al．Constitutive activation of nuclear-factor-kappa B(NF-κB)signaling pathway in fibrolamellar hepatocellular carcinoma[J]．Int J Clin Exp Pathol,2009,3(3)：238-243．

[4] Yang J,Boerm M,Mccarty M,et al．MEKK3 is essential for early embryonic cardiovascular development[J]．Nat Genet,2000,24 (3)：309-313．

[5]Huang Q,Yang J,Lin Y,et al．Differential regulation of interleukin 1 receptor and Toll-like receptor signaling by MEKK3[J]．Nat Immunol,2004,5(1)：98-103．

[6]Yang J,Lin Y,Guo Z,et al．The essential role of MEKK3 in TNF-induced NF-kappa B activation[J]．Nat Immunol,2001,2(7)：620-624．

[7]金亦,邵春奎,唐錄英,等．肝細胞癌中Survivin與NF-κB蛋白的表達及其臨床意義[J]．中華醫學雜志,2011,91(36)：2542-2545．

[8]Samanta A K,Huang H J,Le X F,et al．MEKK3 expression correlates with nuclear-factor-kappaB activity and with expression of antiapoptotic genesin serous ovarian carcinoma[J]．Cancer,2009, 115(17)：3897-3908．

[9] Chiao P J,Na R,Niu J,et al．Role of Rel/NF-kappaB transcirption factors in apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells[J]．Cancer,2002,95(8)：1696-1705．

[10] Lin S S,Lai K C,Hsu S C,et al．Curcumin inhibits the migration and invasion of human A549 lung cancer cells through the inhibition of matrix metalloproteinase-2 and-9 and vascular endothelial growth factor(VEGF)[J]．Cancer Lett,2009,285(2)：127-133．

Expression of MEKK3,NF-κB proteins in esophageal squamous cell carcinoma and their clinical significance

Objective To study the expression of mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase kinase 3(MEKK3)and nuclear factor kappa B(NF-κB)proteins in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)and their clinical significance．MethodsThe expression of MEKK3 and NF-κB proteins in 76 cases of ESCC,35 cases of adjacent atypical hyperplasia tissues and 20 cases of normal tissue were detected by immunohistochemistry EnVision method．ResultsThe positive rates of MEKK3 protein in ESCC tissue were significantly higher than those of atypical hyperplasia tissue and normal tissue(P＜0．05)．The positive rates of NF-κB protein were increased gradually in ESCC tissue,atypical hyperplasia tissue and normal tissue．In ESCC tissue,the positive expression of MEKK3 and NF-κB proteins was both correlated with the clinical stage,infiltration depth and lymph node metastasis(all P＜0．05),but not correlated with age,sex,or degree of differentiation(all P＞0．05)．Expression of MEKK3 protein was positively associated with expression of NF-κB(r=0．308,P＜0．05)．ConclusionThe expression of MEKK3 and NF-κB proteins can be used as a indicator for the diagnosis of ESCC and the prognosis of patients．

MEKK3 NF-κB Esophageal squamous cell carcinoma

2013-05-27）

（本文編輯：胥昀）

315031 寧波市臨床病理診斷中心診斷部

殷憲剛，E-mail:yinxiangang@126.com