姜黃素納米結構脂質載體的藥動學

萬 坤, 孫立力, 胡雪原, 楊 梅, 張景勍

（重慶醫科大學藥物高校工程研究中心和生物化學與分子藥理學重點實驗室, 重慶 400016）

姜黃素納米結構脂質載體的藥動學

萬 坤, 孫立力, 胡雪原, 楊 梅, 張景勍

（重慶醫科大學藥物高校工程研究中心和生物化學與分子藥理學重點實驗室, 重慶 400016）

目的 建立測定大鼠血漿中姜黃素的 HPLC法， 并研究姜黃素納米脂質體大鼠灌胃給藥后的藥動學行為。 方法12 只 SD大鼠隨機分成 2 組， 單劑量灌胃給予納米脂質體及游離姜黃素后， 采用 HPLC法測定血漿中藥物濃度， 計算藥代動力學參數。結果 建立了姜黃素在大鼠血漿中的測定方法。結果表明納米脂質體在大鼠體內吸收迅速，清除率降低， 其 AUC（0-t）為 （930.08 ±18.95） μg·h/L，t1/2為 （10.71 ±3.30） h， Cmax為 （117.57 ±4.61） μg/L， 相對于游離藥物， 納米脂質體的生物利用度提高了約 800%。 結論 納米脂質體是姜黃素較好的遞送系統， HPLC法可用于大鼠血漿姜黃素測定及藥代動力學研究。

姜黃素;納米脂質體;藥代動力學;大鼠血漿

姜黃素 （Curcumin） 為中藥姜黃的主要成分，現代藥理研究表明姜黃素有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、 利膽、 降血脂、 抑菌 等多種 藥 理 作用［1-5］， 但由于姜黃素難溶于水，在體內不易吸收，生物利用度低， 且代謝快，半衰期短［6-7］， 限制了 其在臨床上的廣泛應用。 納米結構脂質載體（Nanostructured lipid carriers， NLC） 是 在固體脂質納米粒 （ Solid lipid nanoparticles， SLN） 的基礎上發展起來的第二代固體脂質納米粒，也是一種新型的納米結構給藥系統， NLC作為藥物載體， 結合了含藥微乳和脂質體的特點，通過向固體脂質中加入化學性質差異較大的液態油，使納米粒以結晶缺陷型或無定型結構存在，增加了輔料對藥物的包容性，避免了藥物以放置過程中的泄漏和因此導致包封率下 降 的 缺 陷［8-10］。本 研 究 以 姜 黃 素 為 模 型 藥物，在制備載藥微乳的基礎上，進一步通過薄膜分散法，制備了具有較高包封率的姜黃素納米結構脂質載體，并對其特性和大鼠體內的藥代動力學進行了考察，為臨床研究具有較高生物利用度的姜黃素制劑提供了依據。

1 材料與儀器

1.1 儀器 Agilent1100 液相色譜儀 （美國 Agilent公司）;TGL-16B臺式高速離心機 （上海安亭科學儀器廠）;DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）;AB 204 S 電子分析天秤 （ 瑞士 Mettler Toledo儀器公司）;DZF-1型真空干燥箱 （上海躍進醫療器械廠）;JEM-1230透射電鏡 （ 日本電子株式會社）;Nicomp380 ZLS粒徑測定儀 （美國 PSS 公司）。

1.2 藥品 姜黃素 （純度 ＞99%， 南通飛宇生物科技公司）、 單硬脂酸甘油酯 （德國 BASF公司）、卵磷脂 （鄭州明欣化工有限公司）、 油酸乙酯 （分析純， 上海化學試劑二廠）、 聚乙二醇 Polyethylene glycol-400 （分析純， 天津精細化工有限公司）， 聚氧乙烯蓖麻油 （EL-35， 上海士峰生物科技公司）、吐溫 -80 （成都市科龍化工試劑廠）、 三棕櫚酸甘油酯 （上海紫一試劑廠）、 乙腈 （色譜純， 美國新天地科技有限公司）、 冰醋酸 （色譜純， 川東化學試劑廠），其余試劑為分析純或色譜純。

1.3 動物 體質量為 200 ～250 g健康的 SD大鼠（重慶醫科大學實驗動物中心提供， 許可證號: SCXK （渝） 2012-0001; 合格證編號:SCXK （渝）2012-0001。 試驗期間自由飲水， 試驗前禁食 12 h。

2 方法與結果

2.1 高包封率的姜黃素納米結構脂質載體的制備稱取 50 mg姜黃素、 1.65 g油酸乙酯、0.45 g PEG-400 及 0.60 g EL-35， 40 ℃水浴中避光磁力攪拌3 h后，置于20 ℃的水浴中攪拌， 邊攪拌邊將水緩慢滴加至制劑中， 避光攪拌 20 min， 即得姜黃素的微乳制劑。再稱取處方量的單硬脂酸甘油酯、卵磷脂、 三棕櫚酸甘油酯， 置于 250 mL的圓底燒瓶中，加入 20 mL無水乙醇，40 ℃的水浴中， 避光旋干，使圓底燒瓶內壁形成一層均勻分布的薄膜，加入姜黃素的微乳制劑;另稱取處方量的吐溫 -80， 加入 5.0 m L純化水， 超聲使其充分溶解。 將吐溫 -80 溶液加入到圓底燒瓶中，置冰浴中超聲，使圓底燒瓶內壁的薄膜脫落，即得姜黃素納米結構脂質載體黃色乳狀混懸液。利用葡聚糖凝膠柱色譜法測定其包封率為 （90.36 ±2.99）%， 載藥量為 （1.36 ±0.23）%， 并用粒徑測定儀測 定 制 劑 的 粒 徑 232.7 nm， Zeta 電 位為 -10.8 mv。

2.2 姜黃素納米結構脂質載體大鼠體內藥動學實驗設計 取體質量約 250g的雄性 SD大鼠 12 只，隨機分為兩組:第1組灌胃給予姜黃素混懸液（50mg/kg）， 第 2 組灌胃給予的姜黃素納米結構脂質載體制劑 （50 mg/kg）。 給藥前禁食 12 h， 不禁水。 分 別 在 給 藥 后 0.08、 0.17、 0.25、 0.5、0.75、 1、 1.5、 2、 3、 4、 6、 8、 10、 12、 24、 48、72 h 眼底靜脈采血0.3mL于肝素浸潤過的試管中，6 000 r/min 離心 10 min 后分離血漿， 取 200 μL血漿于潔凈試管中， 放入-20 ℃冷凍， 待測。

2.3 血漿樣品預處理 吸取血漿樣品 200 μL于5 mL離心 管， 加入 尼群地 平內標工作液 （1 μg/mL）20 μL， 再加入乙酸乙酯 1.0 mL， 漩渦2 min后， 12 000 r/min 離 心 10 min， 轉 移 上層有機相于另一離心管中，利用氮氣吹干儀吹干溶劑后，用 100 μL流動相復溶， 取復溶液 20 μL進樣。

2.4 定量測定方法

2.4.1 色 譜 條 件 Chrospher C18色 譜 柱 （ 250 mm×4.6 mm，5 μm）; 柱 溫 30 ℃; 流 動 相 乙 腈-5%冰 醋 酸 溶 液 （45 ∶55） （V/V）; 體 積 流 量1 mL/min; 紫外檢測波 長 426 nm。

2.4.2 專屬性考察 將供試動物的空白血漿色譜圖、空白血漿中加入待測物和內標物后得到的色譜圖及給藥后大鼠血漿色譜圖進行比較，色譜情況見圖1。 結果表明， 在本實驗選定的色譜條件下， 空白血漿中內源性物質和其他雜質對姜黃素及內標和厚樸酚的測定無干擾，峰型良好;姜黃素及內標的保 留 時間分別 為 11.73 min、 9.50 min。

圖 1 空白血漿 （A）， 空白血漿中加姜黃素 （100 ng/m L） 及內標 （100 ng/m L） （B）， 大鼠灌胃給藥姜黃素納米結構脂質載體 60m in后 （ C） 及大鼠灌胃給藥姜黃素 60m in后 （ D） 的色譜圖Fig.1 Chromatograms of blank rat plasma sample（ A） ， the rat plasma spiked with curcum in（100 ng/m L） and internal standard solution （100 ng/m L） （ B） ， the rat p lasma sam p le collected at60 m in after oral adm inistration of curcum in nanostructu red lipid carriers（ C） and the rat p lasma sam p le collected at 60 m in after oral adm inistration of curcum in（D）

2.4.3 標準曲線的制備 精密稱量姜黃素 10 mg置于100mL棕色量瓶中， 用甲醇溶液定容至刻度，得質量濃度為 100 μg/mL的姜黃素貯備液; 并配制質量濃度為 1 μg/m L的尼群地平內標工作溶液。吸取不同體積的姜黃素標準溶液，分別置于7個100 mL的棕色量瓶中，甲醇溶液定容至刻度， 得質量濃度分別為 100、500、 1 000、 1 500、 2 000、2 500、 3 000 ng/mL的姜黃素系列標準品溶液，4℃冰箱中保存，備用。

精密吸取各質量濃度的標準溶液20 μL和尼群地平內標溶液 （1 μg/mL） 20 μL至 7 個1.5 mL的離心管中， 氮氣吹干溶劑，各離心管中加入 200 μL空白血漿，配制成含有姜黃素的質量濃度分別為10、 50、 100、 150、 200、 250、 300 ng/mL系列血漿樣品工作溶液 （內標質量濃度為 100 ng/mL）， 按照血漿樣品的處理方法處理后，在選擇的色譜條件下，進樣20 μL， 分別測定各樣品中姜黃素和尼群地平的峰面積，以姜黃素和尼群地平的峰面積比為縱坐標，姜黃素質量濃度為橫坐標，做線性回歸，得回歸方程如下 Y=0.012 8X+0.164 4（r=0.999 5），結果表明， 姜黃素在 10 ～300 ng/mL范圍內與姜黃素和內標的峰面積比呈良好線性關系。

fQRS組再次行PCI治療的有8例(13.11%)；非fQRS組再次行PCI治療的有1例(1.64%)。與非fQRS組相比，fQRS組再次行PCI治療患者占比較高，且差異有統計學意義(χ2=4.319，P=0.015)。

2.4.4 回收率的確定 分別制備姜黃素的低、 中、高 3 個質量濃度 （10、 150、 300 ng/mL） 的血漿樣品溶液按照 “2.4” 項下方法處理， 依照色譜條件，測定姜黃素的峰面積和內標峰面積，并分別與空白血漿經相同方法處理后的殘渣加入10 μL姜黃素各標 準 溶 液 （100、 1 500、 3 000 ng/mL） 和90 μL流動相制備的 質量濃 度為 10、 150、 300 ng/mL的姜黃素的峰面積比較，測定姜黃素提取回收率和內標回收率，姜黃素 3個質量濃度的平均提取回收率均不小于 75%，內標回收率為（82.13 ± 2.6）%。 結果表明， 姜黃素和內標的絕對回收率符合生物樣品分析要求。

2.4.5 精密度和準確度試驗 將低、 中、高 3 個質量濃度 （10、 150、 300 ng/m L） 的姜黃素血漿樣品溶液，分別依照色譜條件，進樣分析，計算精密度和準確度。每一質量濃度1 d內測定5次，計算日內精密度;每一質量濃度1 d測定1次，連續5d， 計算日間精密度; 通過測定， 根據標準曲線計算藥物的質量濃度，與血漿樣品中實際濃度對比， 計算準確度。 所測得樣品的日內精密度 RSD值分別為 1.3%、 0.7%、 0.43% （n=5）， 日間精密度 RSD值分別為 1.62%、 0.97%、 0.51% （n= 5）; 準確度在 ±5.3%范圍內。 測定結果表明， 3個不同質量濃度的姜黃素的精密度和準確度符合生物樣品的分析要求。

2.4.6 穩定性考察 分別配制低、 中、 高 3 個質量濃度 （10、 150、 300 ng/mL） 的姜黃素血漿樣品溶液， 各質量濃度平行配制3份，室溫放置12 h后， 依照 “2.4” 項下方法處理后進樣檢測， 考察室溫放置的穩定性; 冷凍放置 （ -20 ℃） 30 d，考察冷凍放置穩定性。姜黃素的低、中、高3個質量濃度樣品放置 12 h后， 測得的質量濃度為標示質量濃度的 98.2%、 98.4%、101.7%， RSD值分別 為 4.97%、 3.17%、 4.02%; 冷 凍 保 存（ -20 ℃） 30 d 后， 3 個質量濃度樣品測得的質量濃 度 為 標 示 質 量 濃 度 的 98.1%、 101.4%、98.5%， RSD值分別為 4.36%、 3.57%、3.69%，說明姜黃素血漿溶液在 10 ～300 ng/m L質量濃度范圍內在室溫下保存 12 h 和 -20 ℃冷凍保存 30 d后，血漿中被測物濃度可以準確測定。

2.5 數據處理 對按 “2.4” 項處理所得血漿樣品進行分析，同時隨行標準曲線和質量控制樣品分析，分別計算待測組分峰面積與內標物峰面積比值（A a/A i），用標準曲線計算姜黃素的血藥濃度，將血藥濃度-時間數據用 DAS 2.0 軟件計算藥代動力學參數，并將姜黃素與姜黃素納米結構脂質載體混懸液 的 藥 動 學 參 數 AUC（0-∞）、 Tmax、 Cmax、 t1/2、MRT（0-∞）、 CL、V進行方差分析和 q檢驗， 考察藥動學參數差異。

2.6 藥動學試驗結果

2.6.1 平均血藥濃度-時間曲線 大鼠口服灌胃給姜黃素和姜黃素納米結構脂質載體混懸液后（50 mg/kg） 后， 平均血藥濃度-時間曲線見圖 2，其符合2 室模型 （權重系數為 1）。

圖2 大鼠灌胃給藥姜黃素及姜黃素納米結構脂質載體的LgC-t曲線Fig.2 Plasm a LgC-time profile of curcum in and curcum in nanostructured lipid car riers

2.6.2 藥動學參數 姜黃素和姜黃素納米結構脂質載體混懸液的主要藥動學參數見表 1。 結果顯示，與姜黃素相比，姜黃素納米結構脂質載體的體內清除率低， 藥時曲線下面積增大， Cmax增大，藥物在體內吸收增加明顯，消除速率降低;對姜黃素與姜黃素納米結構脂質載體混懸液藥代學參數AUC（0-∞）、 Tmax、 Cmax、 t1/2、 MRT（0-∞）、 CL、 V的方差分析和q檢驗結果表明，兩者的藥代學參數兩兩之間比較， 均有顯著性差異 （P＜0.05）。

3 討論

本實驗建立了利用 HPLC測定血漿樣品中姜黃素的方法，經方法學驗證，本方法簡便、準確、穩定，回收率和精密度均符合生物樣本中藥物量測定的要求［11］， 經大鼠體內藥物動力學實驗和 DAS 軟件分析進一步證實，可用于姜黃素的 NLC制劑的藥代動力學研究。姜黃素納米結構脂質載體與姜黃素原料藥相比，姜黃素納米結構脂質載體的AUC（0-t）明顯大于姜黃素原料藥， 約為 8 倍左右，MRT（0-t）延長了約 8 h，CL明顯減少， 表明利用NLC為載體制備的姜黃素納米結構脂質載體制劑，相對于姜黃素原料藥，其在動物體內的生物利用度有了明顯的提高。

表1 大鼠灌胃給藥姜黃素及姜黃素納米結構脂質載體的主要藥動學參數 （， n=6）Tab.1 Pharmacokinetic parameters of curcum in and curcum in nanostructured lipid carriers in rats（，n=6）

表1 大鼠灌胃給藥姜黃素及姜黃素納米結構脂質載體的主要藥動學參數 （， n=6）Tab.1 Pharmacokinetic parameters of curcum in and curcum in nanostructured lipid carriers in rats（，n=6）

注:*P＜0.05

參數 單位 姜黃素 姜黃素納米結構脂質載體AUC（0-t） μg·h/L 108.78 ±14.22 930.08 ±18.95 AUC（0-∞） μg·h/L 126.99 ±28.14 971.98 ±47.47*MRT（0-∞） h 5.33 ±1.66 13.61 ±3.06*t1/2z h 4.71 ±1.18 10.71 ±3.30*Tmax h 0.25 ±0.07 1.50 ±0.05*CLz/F L/（h·kg） 406.24 ±85.27 51.53 ±2.58*Vz/F L/kg 2 668.38 ±142.38 788.65 ±215.19*Cmax μg/L 72.46 ±2.66 117.57 ±4.61*

文獻報道，有相當數量納米結構制劑可在較短的時間內 （0.5 h） 被消化道直接吸收［12］， 主要途徑包括經消化道上皮細胞直接吸收進入血循環，以及通過上皮細胞或派伊爾結 （ Peyer's patches） 吸收進入淋 巴 循環［13-14］。 姜 黃 素納 米 結 構脂 質 載 體相對生物利用度的提高，可能與姜黃素納米結構脂質載體導致姜黃素的吸收途徑改變有關，由于姜黃素具有溶解性能差，生物利用度低等特點，因而可以利用 NLC可經消化道直接吸收和通過淋巴轉運至體循環的吸收特點，將其應用于姜黃素的口服給藥，對于減少藥物的肝首過效應、提高生物利用度具有潛在的應用價值。

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Pharm acokinetics of curcum in nanostructured lipid carriers in rats'plasm a

WAN Kun， SUN Li-li， HU Xue-yuan， YANG Mei， ZHANG Jing-qing

（ Medicine Engineering Research Center， Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China）

AIM To develop an HPLC method for determining curcumin in rat plasma and to investigate the pharmacokinetic behavior of curcumin nanostructured lipid carriers（CNLC）.METHODS Twelve rats were randomly and evenly divided into two groups， the ratswere subject to a single-dose intragastric administration of curcumin and CNLC.The curcumin and CNLC plasma concentrations at predetermined time weremeasured by HPLC，and then the pharmacokinetic parameterswere calculated.RESULTS The HPLCmethod for determining the curcumin concentrations in rat plasmawere established.The results indicated that CNLC was absorbed quickly and the clearance was decreased.The AUC（0-t）was（930.08 ±18.95 ）μg/L· h， t1/2was（10.71 ±3.30 ） h， Cmaxwas（117.57 ±4.61 ）μg/L， respectively.The bioavailability of CNLC to curcumin was 800%.CONCLUSION The HPLCmethod for determination of plasma curcumin concentration is accurate， simple and reliable， which provides the basis of way for the pharmacokinetic study.CNLC is a promising formulation to deliver curcumin.

curcumin;pharmacokinetics;nanostructured lipid;rat's plasma

R969.1

:A

1001-1528（2014）12-2503-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.013

2013-12-25

重慶市科委基金項目 （CSTC2012JJB10027）

萬 坤 （1982—）， 男， 碩士生， 研究方向: 藥物新劑型與新技術研究。 E-mail:

*通信作者: 張景勍 （1973 —） ， 女， 教授， 博 士 生 導師， 研究 方 向: 納 米藥 物 構 建與評 價。 Tel:13308300303， E-mail:zjqrae01@ 163.com