HPLC法同時測定加味穿心蓮散中 6種成分

汪 芳, 林 吉*, 鄧麗紅, 朱 莉, 賴小平, 張 軍

（1.廣州中醫藥大學新藥開發研究中心, 廣東 廣州 510006； 2.廣東藥學院, 廣東 廣州 510006）

[質 量]

HPLC法同時測定加味穿心蓮散中 6種成分

汪 芳1, 林 吉1*, 鄧麗紅1, 朱 莉2, 賴小平1, 張 軍1

（1.廣州中醫藥大學新藥開發研究中心, 廣東 廣州 510006； 2.廣東藥學院, 廣東 廣州 510006）

目的 建立同時測定加味穿心蓮散 （穿心蓮、木香、厚樸、蒼術和干姜） 中穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯、木香烴內酯、 去氫木香內酯、 和厚樸酚及厚樸酚的高效液相色譜方法。 方法 加味穿心蓮散甲醇提取液采用 Diamonsil C18（5 μm， 250mm ×4.6 mm） 色譜柱分離; 甲醇-水梯度洗脫， 體積流量為 1.0mL/min; 穿心蓮內酯、 木香烴內酯、去氫木香內酯、 和厚樸酚及厚樸酚檢測波長均為 225 nm， 脫水穿心蓮內酯檢測波長為 254 nm， 進樣量為10 μL。 結果上述 6 種成分在 50min 內即達到基線分離， 且分別在 0.046 8 ～0.936 0 μg（r=0.999 99）、 0.051 0 ～1.020 μg（r= 0.999 99）、 0.101 3 ～2.026 μg（ r=0.999 95）、 0.154 1 ～3.081 μg（ r=0.999 96）、 0.050 9 ～1.018 μg（ r= 0.999 98）、 0.116 3 ～2.325 μg（r=0.999 61） 范圍內呈良好線性關系， 各成分的平均加樣回收率在99.3% ～104.0%之間， RSD小于 3%。 結論 本方法簡單， 精確， 可重復， 并對加味穿心蓮散改制成顆粒劑提供質量評價。

加味穿心蓮散;穿心蓮內酯;脫水穿心蓮內酯;木香烴內酯;去氫木香內酯;和厚樸酚;厚樸酚

加味穿心蓮散是由穿心蓮、木香、厚樸、蒼術和干姜等五味藥材粉末制成的散劑，具有清熱解毒、理氣和中、除濕化滯的功效，主要用于治療瀉痢、積滯等腸道疾病。處方中穿心蓮、木香和厚樸是起主要功效的藥材，多含有熱不穩定性成分和揮發油類成分，如:穿心蓮中的穿心蓮內酯在加熱過程中容易脫水轉化為脫水穿心蓮內酯，并且加熱也會導致內酯環的結構破壞， 使兩者的總量下降［1］;木香烴內酯和去氫木香內酯為木香揮發油的主要成分， 也是木香的主要活性成分［2］， 在儲藏過程中易損失，使藥效降低;厚樸主要含有酚類和揮發油類，其中厚樸酚及和厚樸酚為厚樸的主要活性成分，但這2種成分在炮制過程中均易損失，造成市售商品質量參 差不齊［3-4］。 為了 有效地 控制產 品質量，本實驗采用高效液相色譜法對處方中的穿心蓮、木香和厚樸中的主要成分進行測定研究，為評價和控制該制劑的質量提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津 LC-20A高效液相色譜儀 （SPD-20A UV-VIS 檢測器， LC-20AT泵， SIL-20A自動進樣器， Labsolution 色譜工作站）; 十萬分之一分析天平 （ 美 國 Mettler Toledo CP225D） ; 萬分 之 一 分析 天 平 （ 美 國 Mettler Toledo AB204-N）;KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器 （江蘇昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 穿心蓮內酯對照品 （110797-201108），脫水穿心蓮內酯對照品 （110854-201007）， 木香烴內酯對照品 （111524-201208）， 去氫木香內酯對照品 （ 111525-201008 ）， 厚 樸 酚 對 照 品 （ 110729-200412）， 和厚樸酚對照品 （110730-201112）， 均購于中國食品藥品檢定研究院; 蒼術 （產地江蘇，批號 110801）， 干姜 （產地江蘇， 批號 111102），木香 （產地云南， 批號 130601）， 厚樸 （產地云南， 批號130501），均購于大翔制藥有限公司; 穿心蓮 （產地廣西， 批號 11040250）， 購于華濟中藥飲片有限公司。水為超純水;其余試劑為分析純。加味穿心蓮散由華南生物科技有限公司生產，批號分別為 20140105、 20140106、 20140107。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 經優選色譜條件， 確定固定相為Diamonsil C18色譜柱 （5 μm， 250 mm ×4.6 mm）;流動相為甲醇-水，按表 1 梯度洗脫; 穿心蓮內酯、木香烴內酯、去氫木香內酯、和厚樸酚及厚樸酚檢測波長均為 225 nm， 脫水穿心蓮內酯檢測波長為254 nm; 體積流量 1.0 m L/min; 進樣量 10 μL。 在該色譜條件下，穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯、木香烴內酯、去氫木香內酯、和厚樸酚及厚樸酚能達到基線分離， 其他成分對測定無干擾， 見圖1。

表 1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution of mobile phase

2.2 混合對照品溶液的制備 取穿心蓮內酯、 脫水穿心蓮內酯、木香烴內酯、去氫木香內酯、和厚樸酚、厚樸酚對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每 1 mL含穿心蓮內酯 0.468 mg、 脫水穿心蓮內酯 0.510 mg、 木香烴內酯 1.013 mg、 去氫木香內酯 1.541 mg、 和 厚 樸 酚 0.509 mg及 厚 樸 酚1.163 mg的對照品溶液。 再精密量取以上對照品溶液各 1 mL置于 10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含穿心蓮內酯 0.046 8 mg、 脫水穿心蓮內酯0.051 0 mg、 木香烴內酯 0.101 3 mg、 去氫木香內酯 0.154 1 mg、 和厚樸酚 0.050 9 mg及厚樸酚0.116 3 mg的混合對照品溶液， 搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約3 g， 精密稱定， 置具塞錐形瓶中， 精密加入甲醇 50 m L， 稱定質量， 超聲處理 （功率 360 W， 頻率 40 kHz）30 min， 放冷， 再稱定質量， 用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備 按處方分別制備除去穿心蓮藥材、木香藥材、厚樸藥材的陰性樣品，按照 “2.3” 項下的供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

2.5 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液 1、2、 6、 10、 15、 20 μL， 按 “2.1” 項下的色譜條件進行測定。以對照品峰面積為縱坐標 （Y）， 對照品的進樣量為橫坐標 （X）， 分別進行線性回歸， 得到的回歸方程及相應的相關系數， 見表2。 結果表明，穿心蓮內酯在 0.046 8 ～0.936 0 μg、 脫水穿心蓮內酯在 0.051 0 ～1.020 μg， 木香烴內酯在 0.101 3 ～2.026 μg、 去氫木香內酯在 0.154 1 ～3.081 μg、 和厚樸酚在 0.050 9 ～1.018 μg、 厚樸酚在 0.116 3 ～2.325 μg范圍內呈良好的線性關系。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chrom atogram s

表2 各對照品的回歸方程和相關系數Tab.2 Regression equation and correlation coefficient of reference substances

2.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL， 按照 “2.1” 項下的色譜條件測定， 連續進樣6次，測得各色譜峰的峰面積，穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯、木香烴內酯、去氫木香內酯、和厚樸酚、厚樸酚峰面積的 RSD值分別為 0.5%、0.4%、 0.2%、 0.3%、 0.2%、 0.1%， 結果表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗 取同一批樣品粉末約3.0 g， 精密稱定6 份，按照 “2.3” 項下的方法分別制備供試品溶液， 按照 “2.1” 項下的色譜條件分別進行測定，測得樣品中穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯、木香烴內酯、去氫木香內酯、和厚樸酚、厚樸酚的平均 含 有 量 的 RSD 值 分 別 為 1.0%、1.1%、0.6%、 1.0%、 0.8%、 0.4%， 結果表明該方法重復性良好。

2.8 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液， 按照 “2.1” 項下的色譜條件分別在 0、 1、 2、 4、 8、24 h進樣測定， 測得樣品中穿心蓮內酯、 脫水穿心蓮內酯、木香烴內酯、去氫木香內酯、和厚樸酚、厚樸 酚 的 量 的 RSD 值 分 別 為 0.7%、0.5%、0.5%、0.2%、 0.6%、 0.4%， 結果表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.9 加樣回收率試驗 取同一批已知含有量的加味穿心蓮散 6 份，每份約 1.5 g， 精密稱定， 分別精密加入穿心蓮內酯對照品溶液 1.20 m L、 脫水穿心蓮內酯對照品溶液 1.50 mL、 木香烴內酯對照品溶液 2.00 mL、 去氫木香內酯對照品溶液 4.50mL、和厚樸酚對照品溶液3.20 m L及厚樸酚對照品溶液3.00 m L， 用甲醇補足至 50 m L， 再按照 “2.3” 項下的制備方法操作，進樣測定，計算回收率，結果見表3～8。

表3 穿心蓮內酯加樣回收率試驗結果Tab.3 Results of recovery tests for andrographolide

表4 脫水穿心蓮內酯加樣回收率試驗結果Tab.4 Results of recovery tests for didehydroand rographolide

表5 木香烴內酯加樣回收率試驗結果Tab.5 Results of recovery tests for costunolide

表6 去氫木香內酯加樣回收率試驗結果Tab.6 Results of recovery tests for dehydrocostuslactone

表7 和厚樸酚加樣回收率試驗結果Tab.7 Results of recovery tests for honokiol

表8 厚樸酚加樣回收率試驗結果Tab.8 Results of recovery tests for m agnolol

2.10 樣品測定 取3 批加味穿心蓮散樣品，按照“2.3” 項下的方法制備供試品溶液， 各吸取 10 μL注入液相色譜儀中， 按照 “2.1” 項下色譜條件測定分別計算穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯、木香烴內酯和去氫木香內酯、和厚樸酚和厚樸酚的總量，結果見表9。

表 9 樣品測定結果 （n=3）Tab.9 Determ ination resu lts of samples（ n=3）

3 討論

本處方中的穿心蓮、木香、厚樸分別為清熱解毒藥、行氣藥、芳香化濕藥，三者均具有一定的抗炎、抗腹瀉作用。如臨床使用穿心蓮注射液治療仔豬白痢病和胃腸炎等癥， 療效顯著［5］， 并且研究發現穿心蓮內酯可有效緩解番瀉葉和蓖麻油所致小鼠的腹瀉［6］。 亦有文獻報道， 木香可減少蓖麻油引起的小鼠小腸性腹瀉和番瀉葉引起的小鼠大腸性腹瀉次數，對小鼠墨汁胃腸推進運動也有弱的抑制作用［7-8］。 而厚樸醇提物 只可對 抗番瀉 葉性小 鼠腹瀉， 對蓖麻油性腹瀉無明顯影響［9］。 此外，厚樸酚及和厚樸酚為厚樸的主要有效成分，其主要功效為抗腹瀉作用，有文獻表明厚樸酚及和厚樸酚可明顯抑制番瀉葉性小鼠腹瀉［10-11］。

本實驗建立了加味穿心蓮散的穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯、木香烴內酯、去氫木香內酯、和厚樸酚、厚樸酚的定量測定方法，對加味穿心蓮散的6個指標成分進行了提取方式、溶媒種類、溶媒用量、提取時間的考察。在提取方式 （回流、超聲）考察中，2種提取方式的結果相差不大，為了提取方便， 選擇超 聲 提 取; 溶 媒 種 類 （40% 甲醇、70%甲醇、 甲醇） 考察中， 結果顯示直接用甲醇提取，各指標成分的提取率最大; 溶媒用量 （25、50、 75、 100 mL） 和提取時間 （20、 30、 40、 60 min） 考察中， 各指標成分的提取得率差異不大，考慮樣品或飲片可能出現的波動及方法適用性，確定溶媒用量為 50 mL， 提取時間為 30 min。 本方法操作簡單、省時、重復性好，同時測定加味穿心蓮散中6種藥效成分的量，具有實用價值。

本實驗參考 《中國藥典》 中穿心蓮、木香、厚樸的成分定量測定［12］， 對色譜柱、 流動相、 體積流量及檢測波長進行了篩選，并對梯度洗脫時間進行了優化。 此外， 《中國藥典》 2010 年版中穿心蓮、木香、厚樸這三味藥材的成分定量測定分別是以穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯、木香烴內酯和去氫木香內酯、厚樸酚與和厚樸酚的總量計的，所以本實驗樣品的測定結果也選擇以三類成分的總量計。本實驗所建立的加味穿心蓮散的成分定量測定方法，為加味穿心蓮散的質量標準控制提供了科學依據，并為后續顆粒劑的工藝研究奠定了基礎。

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Sim ultaneous determ ination of six constituents in JiaweiChuanxinlian Pow der by HPLC

WANG Fang1， LIN Ji1*， DENG Li-hong1， ZHU Li2， LAIXiao-ping1， ZHANG Jun1

（1.Development&Research Center of New Chinese Drugs， Cuangzhou University of ChineseMedicine， Cuangzhou 510006， China;2.Cuangdong Medicine College， Cuangzhou 510006， China）

AIM To establish an HPLCmethod for simultaneously determining six constituents（ andrographolide， didehydroandrographolide， costunolide，dehydrocostuslactone，honokiol and magnolol） in Jiawei Chuanxinlian Powder（ Andrographitis Herba， Aucklandiae Radix， Magnoliae officinalis Cortex， Atractylodis Rhizoma， Zingiberis Rhizoma）.METHODS The separation was performed on Diamonsil C18（5 μm， 250 mm ×4.6 mm）column withmobile phase consisted ofmethanol-waterwith flow rate of1.0mL/min in gradientelutionmode.The detection wavelength was setat225 nm and 254 nm， respectively.RESULTS Six constituents could bewell separated at baseline in 50 min.The linearity ranges of six constituentswere 0.046 8 ～0.936 0 μg， 0.051 0 ～1.020 μg， 0.1013 ～2.026 μg， 0.154 1 ～3.081 μg， 0.050 9 ～1.018 μg， and 0.1163 ～2.325 μg， respectively.The correlation coefficients of them were0.999 99， 0.999 99， 0.999 95，0.999 96， 0.999 98 and 0.999 61，respectively.The average recovery ranged from 99.3%to 104.0%with RSD less than 3%.CONCLUSION The establishedmethod is simple， accurate， reproducible， and can be used for the quality assessment of Jiawei Chuanxinlian Powder prosessed into granules.

Jiawei Chuanxinlian Powder;andrographolide;didehydroandrographolide;costunolide;dehydrocostuslactone;honokiol;magnolol

R927.2

:A

1001-1528（2014）12-2521-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.017

2014-03-17

國家科技部 “十二五” 國家科技支撐計劃課題 （2011BAI01B01）

汪 芳 （1988—）， 女， 碩士生， 主要從事復方中藥新藥研究與開發。 Tel: （020） 39358519， E-mail:wflzc101@163.com

*通信作者: 林 吉， 男， 研究員， 碩士生導師， 主要從事復方中藥新藥研究與開發。 E-mail:LinJi886@163.com