藏藥二十一味寒水石丸中5個成分的測定

朱林燕, 孔子銘, 謝建鋒, 韓泳平

（西南民族大學(xué)少數(shù)民族藥物研究所, 四川 成都 610041）

藏藥二十一味寒水石丸中5個成分的測定

朱林燕, 孔子銘, 謝建鋒, 韓泳平*

（西南民族大學(xué)少數(shù)民族藥物研究所, 四川 成都 610041）

目的 建立二十一味寒水石丸 （寒水石、 木香、 牛黃、 藏木香等） 中木香烴內(nèi)酯、 去氫木香內(nèi)酯、膽酸、 土木香內(nèi)酯和 異 土木香內(nèi) 酯 的 RP-HPLC測定方 法。 方 法 二十 一 味寒水石 丸 甲醇提取 液 的測定在迪 馬 Diamonsil-2 C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm） 色譜柱進行， 流動相分別為乙腈-水 （65 ∶35）、 甲醇-0.1%醋酸溶液 （75 ∶25） 和乙腈-0.1%磷酸水 （52 ∶48）; 體積流量分別為 1.0、 0.8、 1.0 mL/min; 柱溫均為 30 ℃; 其中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯檢測使用二極管陣列檢測器， 檢測波長 225 nm; 膽酸檢測使用蒸發(fā)光散射檢測器， 漂移管溫度 90 ℃， 氮氣體積流量為 1.6 L/m in; 土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的檢測波長為 220 nm。 結(jié)果 木香烴內(nèi)酯、 去氫木香內(nèi)酯、 膽酸、 土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯線性范圍分別為 0.043 5 ～0.435 μg（r=0.999 8）、 0.045 ～0.45 μg（r=0.999 9）、 0.506 5 ～2.533 μg（r=0.999 9）、 0.64 ～2.4 μg（r=0.999 3）、 0.64 ～2.4 μg（r=0.999 9）; 平均回收率分別為 99.5%、99.7%、 99.8%、 99.3%、 99.6%;RSD分別為 0.8%、 0.9%、 1.3%、 0.7%、 1.1% （n=9）。 結(jié)論 本方法可用于二十一味寒水石丸中5個成分的定量測定。

二十一味寒水石丸; 木香烴內(nèi)酯; 去氫木香內(nèi)酯; 膽酸; 土木香內(nèi)酯; 異土木香內(nèi)酯;HPLC

二十一味寒水石丸為藏醫(yī)常用藥，用于治療高原農(nóng)牧區(qū)常見的胃腸道疾病，屬于藏醫(yī)培根木布病范疇［1-2］。它是由 寒水石、渣馴 膏、波棱 瓜 子、 止瀉木子、木瓜、紫檀香、石榴子、豆蔻子、牛黃、甘青青蘭、綠絨蒿、余甘子肉、唐古特烏頭、沙棘膏、蓽菝、獐牙菜、藏木香、塞北紫堇、木香、訶子肉等二十一味藥材制成的一種復(fù)方制劑，具有健脾和胃、理氣止痛、活血祛瘀，制酸、止痛，愈潰瘍等功效［3］。 臨床上用于治療 “ 培根木布” 引起的各種胃炎、胃潰瘍等疾病。方中木香為菊科植物木香 Aucklandia lappa Decne的干燥根莖，多生長在高山草地和灌木叢中。具有理氣調(diào)中，燥濕化痰等功效［4-5］， 用 于 瀉 痢 后 重、 食 積 不 消、 胸 脘 脹 痛、不思飲食，為二十一味寒水石丸中的常用主藥，木香烴內(nèi)酯和去氫木香烴內(nèi)酯等倍半萜類為其主要活性成分［6-8］， 具有抗炎、 抗菌、 抗 腫瘤等 多方面的生物活性［9-10］。 此 外， 牛黃為常 用 貴 重 藥 材［11-12］，具有熄風(fēng)止痛、清熱解毒等功效，膽酸是其主要活性成分之 一［13-14］， 測定 牛 黃 中的 膽 酸 類成 分 是 評價和控制牛黃及其制劑質(zhì)量的重要指標。而藏木香為菊科植物青木香 Inula racemosa Hook.f的干燥根，具有健脾和胃，調(diào)氣解郁，止痛安胎作用，用于胸肋、脘腹脹痛，嘔吐瀉痢，胸肋挫傷，岔氣作痛， 胎動不安等癥［15］。 經(jīng)研究表明， 土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯是藏木香的主要活性成分，具有顯著的抗炎、保肝活性，可抑制感染人型結(jié)核桿菌，還能清除活性氧自由基［16］。目前， 二十一味寒水石丸的質(zhì)量標準中尚無成分定量測定項，為此，本實驗選擇木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、膽酸、土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯作為指標成分，采用反相高效液相色譜法進行測定，以控制二十一味寒水石丸的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Waters 2695 型高效液相色譜儀;2996 PDA檢測器;ELSD檢測器;METTLER TOLEDO AE240電子分析天平 ［梅特勒-托利多儀器 （上海） 有限公司］;KQ-250B型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）; 所用試劑除甲醇、乙腈為色譜純外，其余為分析純，水為重蒸餾水。木香烴內(nèi)酯（ 批 號 1115242200503 ）、 去 氫 木 香 內(nèi) 酯 （ 批 號11152422005050） 和膽酸 （批號 100078-200414）;土木香內(nèi)酯 （批號 110760-200507）、 異土木香內(nèi)酯 （批號 0761200-002） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院; 二十一味寒水石丸 （由阿壩藏族羌族自治州藏醫(yī)院提供， 批號分別為 201304、201305、 201306）。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 木香的色譜條件 C18色譜柱 （4.6 mm× 250 mm）; 以乙腈-水 （65 ∶35）為流動相; 檢測波長 225 nm; 體積流量 1.0 mL/min; 柱溫 30 ℃;進樣體積10 μL。

2.1.2 牛黃的色譜條件 C18色譜柱 （4.6 mm× 250 mm）; 以甲醇-0.1%醋酸溶液 （75 ∶25） 為流動相; 體積流量 1.0 mL/min; 柱溫 30 ℃; 蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù): 霧化氣體 （N2） 體積流量 1.6 L/min; 氮氣分壓 0.5 MPa; 漂移管溫度 90 ℃。

2.1.3 藏木香的色譜條件 C18色譜柱 （4.6 mm ×250 mm）; 以乙腈-0.1 磷酸水 （52 ∶48） 為流動相; 檢測波長 220 nm; 體積流量 1.0 m L/min; 柱溫 30 ℃; 進樣體積 10 μL。

2.2 木香的測定

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取木香烴內(nèi)酯對照品 8.7 mg、 去氫木香內(nèi)酯對照品 9.0 mg，置于 100 mL量瓶中， 加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的混合對照品溶液 （含木香烴內(nèi)酯 0.087mg/mL， 去氫木香內(nèi)酯0.090 mg/mL）。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取本品 1.5 g，置 100 mL具塞錐形瓶中， 用甲醇溶劑 50 mL，密塞，稱定質(zhì)量。 超聲提取 30 min， 放冷，稱定質(zhì)量，用溶劑補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得測定木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯溶液。

2.2.3 陰性對照品溶液 根據(jù)組方比例， 配制缺木香陰性樣品。 按照 “2.2.2” 項方法制備缺木香的陰性溶液。

2.2.4 木香的系統(tǒng)適用性試驗 分別取含木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各 10 μL， 注入高效液相色譜儀， 按色譜條件進行分析， 木香烴內(nèi)酯在 11.8 min左右出峰， 去氫木香內(nèi)酯在 13.2 min 左右出峰，峰型尖銳、對稱，結(jié)果在與對照品峰保留時間一致的位置上，供試品溶液的木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯峰峰形良好，理論板數(shù)按木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯計算均不低于 3 000， 木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯與相鄰峰的分離度大于 1.5， 陰性對照無干擾峰。 如圖1。

圖1 HPLC圖譜Fig.1 HPLC chrom atogram s

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯混合對照品溶液 0.5、 1.0、 2.0、 3.0、4.0、 5.0 mL置于 10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻， 分別取10 μL注入高效液相色譜儀， 記錄色譜圖。 以進樣量 （μg） 為橫坐標 （X）， 峰面積為縱坐標 （Y） 進行線性回歸， 得回歸方程， 見表1。 結(jié)果表明該方法在較大范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 線性關(guān)系考察Tab.1 Linear correlation

2.2.6 精密度試驗 精密取木香烴內(nèi)酯、 去氫木香內(nèi)酯混合對照品溶液 10 μL， 分別連續(xù)進樣 5次，測得木香烴內(nèi)酯峰、去氫木香內(nèi)酯峰面積的RSD分別為 0.9%、 0.8%， 結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取樣品供試液， 室溫放置，分別在 0、 4、 8、 10、 12 h 取樣 10 μL在高效液相色譜儀上進樣，記錄色譜圖中木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯面積， 計算其 RSD分 別 為 0.4%、0.4%。 結(jié)果表明樣品溶液在 12 h 內(nèi)穩(wěn)定， 滿足測定要求。

2.2.8 重復(fù)性試驗 取同一批樣品 （201304），精密稱取5 份， 按 “2.2.2”項下方法制備樣品溶液， 分別在高效液相色譜儀上進樣 10 μL， 記錄峰面積，計算其質(zhì)量分數(shù)。木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯的 RSD分別為 0.9%、 0.9%。 表明重復(fù)性良好。

2.2.9 回收率試驗 采用加樣回收試驗，取已測定的同一批樣品 9 份 （批號 201304），按高、 中、低劑量，加上一定量的對照品，按供試品測定項下，進行提取，制備， 測定，計算回收率， 見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests

2.3 牛黃中膽酸的測定

2.3.1 膽酸對照品溶液的制備 精密取膽酸對照品 10.13mg置于100 mL量瓶中， 以少量甲醇溶解后稀釋至刻度， 搖勻制成含 0.101 3 mg/m L膽酸的對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取本品 5.0 g，置 100 m L蒸餾瓶中， 用甲醇溶劑 30 mL， 密塞，稱定質(zhì)量， 超聲 30 min， 放冷， 稱定質(zhì)量， 用溶劑補足減失的質(zhì)量， 搖勻、 過濾， 取續(xù)濾液 25 m L，蒸干， 殘渣加 20%NaOH 10 mL， 回流 2 h， 冷卻，加稀鹽酸 19 mL， 調(diào)節(jié) pH 3.1 ～3.5 之間， 依次用25、 20、 15 mL乙酸乙酯萃取 3 次， 均用同一鋪有少量無水 NaSO4的脫脂棉過濾， 合并濾液， 回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解， 轉(zhuǎn)移至 10 mL量瓶中，稀釋至刻度，即得膽酸測定溶液。

2.3.3 陰性對照品溶液 根據(jù)組方比例， 配制缺牛黃陰性樣品。 按照 “2.3.2” 項方法制備缺牛黃的陰性溶液。

2.3.4 牛黃的系統(tǒng)適用性試驗 取膽酸對照品溶液、 供試品溶液及陰性對照溶液各 10 μL， 注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，膽酸在20min 左右出峰， 峰形較為理想， 按膽酸計理論板數(shù)不低于4 000; 膽酸與其他雜質(zhì)峰可達基線分離，分離度大于 1.5; 陰性對照色譜圖中， 在膽酸峰位處無陰性干擾。測定結(jié)果見圖2。

圖2 HPLC圖譜Fig.2 HPLC chrom atogram s

2.3.5 線性關(guān)系考察 精密稱取膽酸對照品溶液（0.101 3 mg/mL） 5、10、 15、20、 25 μL， 注入高效液相色譜儀，測得峰面積。以進樣體積的自然對數(shù) （X） 為橫坐標， 峰面積積分值的自然對數(shù)（Y） 為縱坐標進行線性回歸， 得回歸方程 Y= 1.028 8X+10.034， r=0.999 9， 在 0.506 5 ～2.533 μɡ范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.6 精密度試驗 精密取膽酸對照品溶液10 μL， 分別連續(xù)進樣 5 次， 測得膽酸峰面積的RSD分別為0.03%， 結(jié)果表明精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取樣品供試液， 室溫放置，分別在0、 4、 8、 10、 12 h 取樣 10 μL在高效液相色譜儀上進樣，記錄色譜圖中膽酸峰面積，計算其RSD分別為 0.1%。 結(jié)果表明樣品溶液在 12 h 內(nèi)穩(wěn)定，滿足測定要求。

2.3.8 重復(fù)性試驗 取同一批樣品 （201305），精密稱取5 份， 按 “2.3.2” 項下方法制備樣品溶液， 分別在高效液相色譜儀上進樣 10 μL， 記錄峰面積， 計算其質(zhì)量分數(shù)。膽酸的 RSD為 0.02%。表明重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 取已測定的同一批樣品9 份 （批號 201305）， 按高、 中、 低劑量， 加上一定量的對照品，按供試品測定項下，進行提取，制備，測定， 計算回收率， 具體見表3。

2.4 藏木香的測定

2.4.1 對照品溶液的制備 精密稱取土木香內(nèi)酯對照品、 異土木香內(nèi)酯對照品 16 mg，置于 100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻得土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的混合對照品溶液 （土木香內(nèi)酯、 異土木香內(nèi)酯均為 0.16 mg/mL）。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果Tab.3 Results of recovery tests for cholic acid

2.4.2 供試品溶液的制備 精密稱取本品 2.0 g，置 100 mL具塞錐形瓶中， 用甲醇溶劑 50 mL，密塞， 稱定質(zhì)量。 超聲提取 30 min， 放冷， 稱定質(zhì)量，用溶劑補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯測定溶液。

2.4.3 陰性對照品溶液 根據(jù)組方比例， 配制缺藏木香陰性樣品。按照 “2.4.2”項方法制備缺藏木香的陰性溶液。

2.4.4 藏木香的系統(tǒng)適用性試驗 分別取含土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各 10 μL， 注入高效液相色譜儀， 按色譜條件進行分析， 土木香內(nèi)酯在 32.8 min左右出峰，異土木香內(nèi)酯在 35.3 min 左右出峰，峰形尖銳、對稱，理論板數(shù)按土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯計算均不低于 3 000， 土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯與相鄰峰的分離度大于 1.5，陰性對照無干擾峰。 具體見圖3。

圖3 HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms

2.4.5 線性關(guān)系考察 精密稱取土木香和異土木香內(nèi)酯混合對照品溶液 4、6、 8、 10、 15 mL置于10 mL量瓶中， 加甲醇稀釋至刻度， 搖勻， 分別取10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。 以進樣量 （μg） 為橫坐標 （X）， 峰面積為縱坐標 （Y）進行線性回歸， 得回歸方程， 見表4。 結(jié)果表明該方法在較大范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表4 線性關(guān)系考察Tab.4 L inear correlation

2.4.6 精密度試驗 精密取土木香內(nèi)酯、 異土木香內(nèi)酯的對照品溶液 10 μL， 分別連續(xù)進樣 5 次，測得土木香內(nèi)酯、 異土木香內(nèi)酯峰面積的 RSD分別為 0.7%、 0.3%， 結(jié)果表明精密度良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗 取樣品供試液， 室溫放置，分別在 0、 4、 8、 10、 12 h 取樣 10 μL在高效液相色譜儀上進樣，記錄色譜圖中土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯峰面積，計算其 RSD分別為 0.1%、0.4%。 結(jié)果表明樣品溶液在 12 h 內(nèi)穩(wěn)定， 滿足測定要求。

2.4.8 重復(fù)性試驗 取同一批樣品 （201306），精密稱取5 份， 按 “2.4.2” 項下方法制備樣品溶液， 分別在高效液相色譜儀上進樣 10 μL， 記錄峰面積，計算其質(zhì)量分數(shù)。土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的 RSD分別為 0.6%、0.2%。表明重復(fù)性良好。2.4.9 回收率試驗 采用加樣回收試驗， 取已測定的同一批樣品 9 份 （批號 201306）， 按高、 中、低劑量，加上一定量的對照品，按供試品測定項下，進行提取，制備，測定，計算回收率。結(jié)果見表5。

表5 加樣回收率試驗結(jié)果Tab.5 Results of recovery tests

2.5 樣品測定 取 3 批樣品， 按 “2.2” 項下方法測定峰面積，每份平行測定3次，根據(jù)標準曲線法計算木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、膽酸、土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯的量， 結(jié)果見表6。

3 討論

3.1 提取溶劑和提取方法的選擇 分別考察了甲醇、乙醇和乙酸乙酯等溶劑的提取效果，結(jié)果表明甲醇提取率最高，效果最好;同時對提取方法（回流和超聲） 及提取時間等因素進行了考察，結(jié)果表明在超聲提取 30 min 的條件下提取率較為穩(wěn)定，為最佳實驗條件。

表 6 樣品測定結(jié)果 （n=3）Tab.6 Determ ination result of sam p les（ n=3）

3.2 流動相的選擇 在膽酸的測定中，分別嘗試了甲醇-0.1%醋酸水溶液為 75 ∶25、 80 ∶20、 85 ∶15 等不同比 例［17-18］， 隨甲醇用量 升 高 保 留 時 間 逐漸變短，但是峰與峰之間分離度越差，最終選擇了75 ∶25 這個洗脫體系。 當(dāng)體積流量為 1.0 mL/min時， 柱壓大于 3 000 psi（1 psi=6.895 kPa）， 所以體積流量控制在 0.8 m L/min 為宜。

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Determ ination of five constituents in Ershiyiwei Hanshuishi Pills

ZHU Lin-yan， KONG Zi-ming， XIE Jian-feng， HAN Yong-ping*

（ Ethnic Pharmaceutical Instituteof Southwest University for Nationalities， Chengdu 610041， China）

AIM To establish the method for determining costunolide， dehydrocostus lactone，cholic acid，alantolacton， and isoalantolactone in Ershiyiwei Hanshuishi Pills（ Hanshuishi， Aucklandia lappa Decne.， Bostaurus domesticus Gmelin， I nula racemosa Hook.J， etc）.METHODS The sampleswere separated on Diamonsil-2 C18column （4.6mm×250 mm， 5 μm） using acetonitrile-water（65 ∶35）， methanol-0.1%acetic acid （75 ∶25） and acetonitrile-0.1%phosphoric acid （ 52 ∶48 ） asmobile phase with the flow rate of 1.0 mL/min， 0.8 mL/min and 1.0 mL/min， respectively.The column temperature was kept at30 ℃.2996PDA detector was used for costunolide and dehydrocostus lactone.The detection wavelength was 225 nm and ELSD was used for cholic acid.The flow rate of nitrogen was 1.6 L/min and the temperature of drift tube was 90 ℃.The detection wavelength was 220 nm for lantolactone and isoalantolactone.RESULTS The linear ranges for costunolide， dehydrocostus， cholic acid， alantolactone and isoalantolactone were 0.043 5-0.435 μg（r=0.999 8）， 0.045-0.45 μg（r=0.999 9）， 0.506 5-2.533 μg（r=0.999 9）， 0.64-2.4 μg（r=0.999 3） and 0.64-2.4 μg（r= 0.999 9）， respectively.The average recovery rateswere 99.5%， 99.7%，99.8%，99.3%and 99.6%， respectively.The RSD were0.8%，0.9%， 1.3%，0.7%and 1.1%，respectively.CONCLUSION Thismethod is suitable for the quantitative determination of Ershiyiwei Hanshuishi Pills.

Ershiyiwei Hanshuishi Pills;costunolide;dehydrocostus lactone;cholic acid;alantolactone; isoalantolacton;HPLC

R927.2

:A

1001-1528（2014）12-2526-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.018

2014-04-21

國家十二五科技支撐計劃 （2012BAI27B07）; 西南民族大學(xué)碩士點建設(shè)項目 （2014XWD-S0703）

朱林燕 （1990—）， 女， 碩士生， 主要從事天然藥物的化學(xué)與質(zhì)量研究。

*通信作者: 韓泳平， 教授， 碩士生導(dǎo)師。 Tel: （028） 85522315， E-mail:yphan65@tom.com