LC-MS/MS法檢查保健食品和中成藥中非法添加磺胺藥

姜建國, 張西如, 張軼華, 宋更申

（河北省藥品檢驗研究院, 河北 石家莊 050011）

LC-MS/MS法檢查保健食品和中成藥中非法添加磺胺藥

姜建國, 張西如, 張軼華, 宋更申

（河北省藥品檢驗研究院, 河北 石家莊 050011）

目的 建立 LC-MS/MS 方法檢查保健食品和中成藥中非法添加的 22 種磺胺類藥物。 方法 磺胺脒、 甲氧芐啶、磺胺二甲異嘧啶鈉、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺甲二唑、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺多辛、磺胺甲噁唑、磺胺異噁唑、磺胺苯酰、磺胺喹沙啉、 磺胺苯吡唑、 磺胺硝苯和磺胺間二甲氧嘧啶的乙腈溶液的 HPLC分析， 采用 C18色譜柱， 梯度洗脫; 流動相 A為 0.1%甲酸， 流動相 B為乙腈， 體積流量 0.3 mL/min。 質譜選擇正離子模式和 MRM掃描方式。 結果 通過比較樣品和對照品峰的一級和二級質譜圖可測定上述磺胺類藥物的最小檢出量為 1 pg。 結論 本法對 38 批保健食品和中成藥進行分析，4批樣品出現一級和二級質譜與磺胺甲噁唑和甲氧芐啶對照品一致的圖譜。

磺胺類藥物; 非法添加;LC-MS/MS; 保健食品; 中成藥

磺胺類藥物為人工合成的抗菌藥，用于臨床已近50年， 它具有抗菌譜較廣、 性質穩定、 使用簡便、 生產時不耗用糧食等優點。 特別是 1969 年抗菌增效劑——甲氧芐氨嘧啶 （TMP） 發現以后，與磺胺類聯合應用可使其抗菌作用增強、治療范圍擴大，因此，雖然有大量抗生素問世，但磺胺類藥物仍是中藥的化學治療藥物。由于磺胺類藥主要經肝代謝滅活，形成乙酰化物的溶解度降低，因此，易引起血尿、結晶尿及腎損害，其不良反應還有惡心、嘔吐、皮疹、發熱、溶血性貧血、粒細胞減少、肝臟損害等，故肝腎功能差的尿路感染患者應慎用。近年來，在具有止咳平喘中藥制劑和保健品中摻雜化學合成藥物的情況時有發生，對消費者的身體健康造成嚴重危害。現有的國家標準只能分別檢查單個或幾個藥物，對保健食品和中藥制劑的定性檢查效率不高， 目前 HPLC、 LC/MS 和 GC/MS技術已廣泛用于同時測定多種成分［1-10］，且已有文獻報道測 定 磺胺 類 藥 物［11-14］。 本 實 驗 建立 可 同 時檢查 22 種磺胺類藥物的 LC-MS/MS 檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 API3200 型三重四級桿串聯質譜儀 （美國 Applied Biosystems公司）;Milli-Q去離子水止水系統 （ 美國 SPEXCertiPrep 公司）; 磺胺脒 （SGN， 批號 10916）、 甲氧芐啶 （TMP， 批號00802）、 磺胺二甲異嘧啶鈉 （SIM，批號 20727）、磺胺醋酰 （SAA， 批號 00521）、 磺胺嘧啶 （SDZ，批號 00818）、 磺胺吡啶 （SPD， 批號 10121）、 磺胺 甲 嘧 啶 （ SMR，批 號 10903）、 磺 胺 二 甲 唑（SMO，批號 90928）、 磺胺二甲嘧啶 （SDM， 批號10310）、 磺胺甲氧嗪 （ SMP， 批號 00514）、 磺胺甲二唑 （SMT， 批號 20324）、 磺胺對甲氧嘧啶（SMD，批號 20411）、 磺胺間甲氧嘧啶 （SMM， 批號 01104）、 磺胺氯噠嗪 （SCP， 批號 20621）、 磺胺多辛 （SDX， 批號 01109）、 磺胺甲噁唑 （SMZ，批號 10405）、 磺胺異噁唑 （ SFZ， 批號 10319）、磺胺 苯 酰 （ SBA，批 號 00416）、磺 胺 喹 沙 啉（SQX， 批 號 80303）、 磺 胺苯吡唑 （ SPA， 批號00216）、 磺胺硝苯 （SAN， 批號 10310） 和磺胺間二甲氧嘧啶 （ SAX， 批號 20104） 對照品均購自Dr.Ehrenstorfer公司，純度均大于 99.0%。 樣品由本院提供。

1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取 22 種對照品適量， 加乙腈溶解并制成質量濃度為 0.1 mg/mL的貯備液。 用乙腈 -0.1%甲酸水 （20 ∶80） 配制成混合對照品溶液并稀釋至所需要的系列質量濃度， 取系列溶液10 μL進樣測定， 以定量提取離子對的積分值制成質量濃度-面積標準曲線。

1.3 樣品溶液的制備 取所需測定樣品10 片 （片劑、 膠囊和散劑）， 將內容物研細， 精密稱取0.1 g至 50 mL的量瓶中， 加乙腈適量， 超聲 （250 W，40 kHz） 提取 30 min， 放至室溫并用乙腈稀釋至刻度， 搖勻， 用 0.2 μm的濾膜過濾， 精密量取濾液適量， 用乙腈-0.1%甲酸水 （20 ∶80） 稀釋至線性范圍內質量濃度， 搖勻， 即得。 取 10 μL， 進樣測定。

2 結果

2.1 色 譜 條 件 Altantis T3 色 譜柱 （2.1 mm× 100 mm， 3 μm）; 流動相 A為 0.1%甲酸， 流動相B為乙腈; 梯度洗脫 （0 ～5 min， 0.5% ～10%B; 5 ～25 min， 10% ～50%B;28 min 恢復到初始， 平衡 5 min）; 體積流量 0.3 mL/min; 柱溫 30 ℃。

2.2 質譜條件 電噴霧離子源 （ESI）; 離子噴霧電壓 （IS） 5.5 kV; 離子源溫度 （TEM） 550 ℃;氣簾 氣 （ CUR） 10 L/min; 霧 化 氣 （ GAS1） 40 L/min; 輔助氣 （GAS2） 30 L/min; 采集方式為多反應監測 （MRM）。 正離子化模式選擇和提取離子選擇均以靈敏度高、穩定性好為前提條件。各化合物的定性和定量離子見表 1， 色譜圖見圖1。

表1 質譜相關參數Tab.1 Mass spectrometry parameters

3 方法學考察

3.1 線性關系考察 取 “1.2” 項所示貯備液逐一稀釋成系列質量濃度溶液 10 μL進樣，計算各成分的線性方程，相關系數和 RSD值 （n=6）， 詳見表2。

3.2 精密度試驗 取 “表 2” 22 種藥物的中間濃度， 分別進樣 10 μL， 連續進樣 6 次， 記錄色譜圖， 分別計算 RSD （n=6）， 最大值為 1.8%。

圖 1 22 種磺胺類藥物的選擇離子色譜圖Fig.1 Chromatograms of 22 kinds of sulfonam ides in SIM mode

3.3 溶液的穩定性 分別取 “表 2”22 種藥物的中間濃度置于室溫下放置， 于 0、 2、 4、 6、 8 h，取 10 μL進樣， 記錄色譜圖， 峰面積 RSD （n=6）最大值為1.5%， 表明22 種溶液在 8 h 內均穩定。

3.4 檢出限 將 22 種對照品貯備液逐級稀釋， 以S/N=3 計算檢出量， 以上藥物的檢出量最低為1 pg。

表 2 22 種藥物的線性方程， 線性范圍， 線性相關系數Tab.2 Linear equation， linear range， correlation coefficient and recovery of 22 drugs

4 實際樣品的測定

利用建立的方法對我所近 5年檢查的38批保健食品和中成藥進行分析，4批樣品出現一級和二級質譜與磺胺甲噁唑和甲氧芐啶對照品一致的圖譜，進一步經二極管陣列檢測器檢測，其紫外光譜亦與磺胺甲噁唑和甲氧芐啶對照品一致，判定這4批樣品中非法添加了磺胺甲噁唑和甲氧芐啶，其余樣品均未檢出。見表3。

表 3 22 種藥物在樣品中的測定結果 （n=3）Tab.3 Results of 22 drugs in samples（ n=3）

5 討論

5.1 標準溶液和樣品溶液的配制 磺胺類藥物的基本結構為對氨基苯磺酰胺，大多數此類藥物在水中的溶解度較低，且對光不穩定，所以應使用乙腈作為溶劑配制磺胺類對照溶液，并避光保存。在液相色譜分析中，樣品稀釋一般都使用有機溶劑和水的混合液體。 實驗中發現當使用乙腈-水或甲醇-水的混合溶液時，稀釋溶液中有機溶劑的比例高于色譜洗脫程序起始時有機相比例的2倍時，就會出現色譜峰分裂現象，各成分的峰形對稱，無拖尾現象。

5.2 樣品的提取 由于保健食品和中成藥多為片劑、膠囊、軟膠囊和顆粒劑等，且大多為復方制劑，中成藥中每味中藥材的成分又十分復雜，對分析方法的選擇性要求更高， 因此本實驗采用 LCMS/MS 對其中添加的磺胺類藥物進行定性分析，并定量測定。

樣品的提取方法不盡相同，對片劑、膠囊劑等固體制劑可以直接研細，稱取細粉加乙腈溶解、過濾即可，對含糖較多的顆粒劑用乙腈溶解時，可以消除蔗糖的干擾，有效的保護色譜柱，提取方法操作簡單。

5.3 樣品的測定結果 從表 3 中可以看出， 4 批樣品被檢測出磺胺甲噁唑和甲氧芐啶，其中3批樣品為中成藥散劑，且其中一批檢出量較高，檢出率為 10.5%。因此應加強對中成藥非法添加的控制。

5.4 色譜和質譜條件的優化 實驗中，使用幾種不同的反相色譜柱進行分離，結果發現在現有的色譜洗脫條件下， Altantis T3 （2.1 mm×100 mm， 3 μm）由于填料顆粒細，使峰形更加對稱尖銳， 信噪比更高，因此最終選擇該色譜柱作為分離柱。可以將同分異構體及母離子和碎片離子一致的藥物區分開，使定性更準確，在流動相中加入適量甲酸，可以提高靈敏度， 經試驗當甲酸的使用量在 0.1%為宜。

5.5 建立了 HPLC-MS/MS 同時測定 22 種磺胺類藥物的方法，記錄了所測化學藥的紫外光譜、一級質譜和二級質譜圖，使用質譜儀自身所配軟件儲存上述信息，并錄入相應名稱、結構等信息，當分析未知物時，可先根據采集的信息在庫中搜索匹配的藥物，再用相應的對照品進樣分析，既減少了交叉污染的可能性，又可以節省大量的摸索試驗時間，實現短時間內對未知成分進行確認的目的，方法操作簡便、快速可靠、靈敏度高，可以用于監測保健食品和中成藥中的違法添加化學藥的情況，為市場監管提供技術支持。

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Detecting illegally added sulfonam ides in health foods and herb preparations by LC-MS/MS

JIANG Jian-guo， ZHANG Xi-ru， ZHANG Yi-hua， SONG Geng-shen

（ Hebei Provincial Institute for Drug Control， Shijiazhuang 050011， China）

AIM To establish LC-MS/MSmethod to detect illegally added twenty-two kinds of sulfonamides in health foods and herb preparations.METHODS The analysis of the acetonitrile solutions of SGN， TMP， SIM，SAA， SDZ， SPD， SMR， SMO， SDM， SMP， SMT，SMD，SMM， SCP， SDX， SMZ， SFZ， SBA，SQX，SPA，SAN， and SAX were performed on C18chromatographic column in a gradient elution mode.Mobile phase consisted of 0.1%formic acid （ A phase） and acetonitrile（ B phase） ， the flow rate was 0.3 mL/min.Cationic mode and MRM scanning were selected in NM analysis.RESULT Comparison wasmade between the primary and secondarymass spectra of samples and reference compounds.The lower detection limit of sulfonamides was 1 pg.CONCLUSION Thismethod successfully detects the presence of SMZ and TMP in the primary and secondary mass spectra in four samples from thirty-eight kinds of health foods and herb preparations.

sulfonamides;illegally added;LC-MS/MS;health foods;herb preparations

R927.2

:A

1001-1528（2014）12-2542-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.021

2013-11-27

姜建國 （1965—）， 碩士， 主任藥師， Tel: （0311） 85212004-8040， E-mail:49567976@qq.com