丹皮酚通過抑制 NF-κB信 號 通 路下調 MMP-9 的表達改善心梗后大鼠的心室重構

周曉慧, 趙靜怡, 張樹峰, 徐 倩

（承德醫學院, 河北 承德 067000）

[科研報道]

丹皮酚通過抑制 NF-κB信 號 通 路下調 MMP-9 的表達改善心梗后大鼠的心室重構

周曉慧, 趙靜怡, 張樹峰, 徐 倩

（承德醫學院, 河北 承德 067000）

目的 探討丹皮酚對大鼠心肌梗死后， NF-κB、 MMP-9 表達的影響。 方法 將結扎左冠狀動脈前降支后 24 h 的Wistar大鼠隨機分為模型組、 丹皮酚［4、 6、 8 mg/（ kg·d） ］ 組、 卡托普利組及假手術組。 給藥 4 周后。 測量各組大鼠心 /體比， 采用 Western-blot法檢測各組 大鼠左室后壁心肌組織 NF-κB-P65、 MMP-9 的表 達。 結果 與假 手術組比較， 模型組心/體比明顯增加 （P＜0.05）， NF-κB-P65、 MMP-9 的表達顯著升高 （P＜0.01， P＜0.05）; 與模型組比較， 丹皮酚 ［4、 6、 8 mg/（kg·d）］ 組、 卡托普利組心/體比明顯降低 （P＜0.05）， NF-κB-P65、 MMP-9 的表達顯著降低 （P＜0.05）。 結論 心梗后心室重構過程， NF-κB-P65、 MMP-9 的表達增加， 共同參與了心室重構， 丹皮酚通過抑制 NF-κB-P65， 下調 MMP-9， 逆轉心梗后的心室重構。

心肌梗死; 心室重構; 丹皮酚;NF-κB;MMP-9

急性 心 肌梗死 （ acute myocardial infarction） 是導致慢性充血性心力衰竭的最主要病因之一，在急性心肌梗死后進展為心力衰竭的過程中，常常發生心室重構，心室重構是導致心力衰竭發生發展的關鍵，心室重構包括心肌實質性重構和心肌間質重構，心肌實質重構是指心室肥厚，心肌細胞病理性肥大、變性和壞死，心肌間質重構是指成纖維細胞的增生、 纖維化及細胞外基質 （ECM） 膠原網的量和組成的變化。以前認為心肌在重構中扮演主要角色，目前則認為 ECM纖維膠原合成和降解之間動態平衡在心臟重構過程中的作用十分重要。 ECM重縮是心肌梗死后心臟功能的決定因素［1］。 基質金屬蛋白酶 （ MMPs） 是一組依賴于 Zn2+的蛋白酶家族， 是 ECM的水解蛋白， 其中 MMP9是 MMPs家族的主要成員之一。 大量的研究證實無論心梗的早期重構， 還是晚期重構， MMP2、 MMP9 都有持續的高水平的表達［2］。

研究表明，丹皮酚具有抗炎、抗氧化、抗血栓及抗動脈粥樣硬化等廣泛的藥理作用，本課題組前期研究還發現丹皮酚可通過抑制 TLR4 信號通路改善心室重構［3］， 本研究旨在探討丹皮酚在抗心梗后心室重構的過程中對基質金屬蛋白酶 （MMP） 活性的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 動物、 試劑和主要儀器 健康雄性 Wistar大鼠， 體質量 （250 ±20） g， 購自北京阜康生物科技有限公司， 許可證號:SCXK （京） 2009-0004。 丹皮酚注射液， 寧波天真制藥有限公司 （10 mg/2 mL， 批號 0110603）， 卡托普利，江蘇平光制藥有限公司， 25 mg/片， 批號 120102。 兔抗大鼠 NF-κB p65 多克隆抗體; 小鼠抗大鼠 MMP-9 單克隆抗體購自 Santa Cruz公司; 辣根過氧化物酶標記山羊抗兔和兔抗小鼠 IgG購自北京中杉金僑生物技術有限公司; 增強化學發光 （ enhanced chem iluminescence， ECL） 試劑盒購自 Millipore公司; 其他試劑均為市售的分析純。 DW3000-B型小動物人工呼吸機， 淮北正華生物科技有限公司;ECG-11D心電圖機，惠州科美思醫用儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 急性心肌梗死大鼠模型制作 參照文獻 ［4］ 方法，8% 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后， 仰臥位固定大鼠，經氣管插管連接呼吸機，左胸縱切口，逐層分離，三、四肋間開胸，分離心包，暴露心臟，于左心耳下緣2 mm處使用無菌線完全結扎左冠狀動脈前降支，觀察大鼠心電圖ST段變化， 以 ST段持續抬高并出現室性心律失常， 判斷心肌梗死模型成功。假手術組僅在相應部位穿線，不結扎冠狀動脈。排除胸腔內氣體，逐層關胸，自主呼吸恢復后拔出氣管插管， 縫合皮膚， 術后腹腔注射青霉素 20萬單位/d， 連續 3 d， 預防感染。

1.2.2 實驗分組和給藥方法 將術后存活的模型成功動物隨機分為模型組、 丹皮酚低劑量組 ［4 mg/（kg·d）， n= 10］、 丹皮酚中劑量組 ［6 mg/（kg·d）， n=10］、 丹皮酚高劑量組 ［8 mg/（ kg·d）， n=10］、 卡托普利組 ［10 mg/（kg·d）， n=10］， 另設假手術組 （n=8）。 術后第 2天開始給藥，每日1次，丹皮酚注射液腹腔注射，卡托普利灌胃給藥，假手術組和模型組分別給予等量的生理鹽水代替丹皮酚注射液腹腔注射，等容積生理鹽水代替卡托普利灌胃。每周稱定質量調整藥量1次，連續給藥4周。4周后各組存活動物數分別為模型組7只，丹皮酚低劑量組8只，丹皮酚中劑量組8只，丹皮酚高劑量組9只，卡托普利組8只， 假手術組 8只。

1.2.3 標本采集及處理 4 周后， 各組大鼠稱定體質量，然后斷頸處死，開胸迅速取出心臟，稱心臟質量，計算心質量與體質量的比值 （ 心 /體） 。 可以看到梗死區呈蒼白色，非梗死區呈深紅色，剪取左室后壁組織，一部 分 標 本 以 10% 甲 醛 固 定， 石 蠟 包 埋， 其 余 部 分-80 ℃保存備用。

1.2.4 心肌組織 HE染色 取上述石蠟標本相應部位的連續切片各3張， 作HE染色， 觀察心肌組織結構變化。

1.2.5 Western-blot測定 NF-κB、 MMP9 的表達 取左室后壁心肌組織，制備心肌組織勻漿，提取心肌組織總蛋白，采用 BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量， 取組織蛋白提取上清液進行 SD-PAGE凝膠電泳。 電泳分離后的蛋白轉移到PVDF膜上， 加上 5%脫脂奶粉溶液封閉 4 ℃過夜， 依次加入鼠源 的 NF-κB、 MMP9 和 β-actin 抗 體， 4 ℃ 孵 育 過 夜 ，TBST洗滌 3 次， 10 min/次 ， 再 用 相 應 Ⅱ 抗 室 溫 孵 育 1 h，化學發光 ECL顯色劑顯色， X光膠片顯影、 定影， 蛋白條帶用 Quantity One凝膠 分 析 軟 件 進 行 半 定 量 分 析， 以 靶 蛋白條帶的吸光度值與 β-actin 蛋白條帶吸光度值的比值表示靶蛋白的水平。

2 結果

2.1 各組大鼠心 /體比 模型組心 /體比較假手術組明顯升高， 丹皮酚處理組心/體比， 較模型組均有降低， 高劑量組較為明顯， 卡托普利組心/體比， 較模型組明顯降低。 見表1。

表 1 各組大鼠心/體比 （）

表 1 各組大鼠心/體比 （）

注: 與假手術組比較，*P＜0.05; 與模型組比較，#P＜0.05

組別 動物數/只心質量/ mg體質量/ g（心/體比）/（mg·g-1）8 756.28 ±12.56 256.45 ±13.39 2.95 ±0.049模型組 7 798.35 ±25.24 249.32 ±10.25 3.20 ±0.067*丹皮酚低劑量 8 780.63 ±22.52 255.65 ±9.45 3.05 ±0.089#丹皮酚中劑量 8 768.56 ±19.45 251.35 ±12.23 3.05 ±0.065#丹皮酚高劑量 9 760.79 ±15.56 258.23 ±11.57 2.94 ±0.043#卡托普利 8 762.38 ±20.34 254.67 ±9.98 2.99 ±0.053假手術組#

2.2 HE染色各組大鼠心肌結構變化 假手術組肌絲完整，心肌細胞清晰可見，排列規則、細胞胞質豐富、間隙均勻，模型組部分心肌纖維溶解斷裂、胞間組織松散，細胞核大量消失、固縮、碎裂，胞質嗜酸性染色增強，心肌細胞明顯肥大，心肌組織壞死嚴重，表明急性心肌梗死模型建立成功，丹皮酚中、高劑量組心肌細胞排列及肌纖維溶解斷裂程度介于假手術組與模型組之間，表明丹皮酚對心室重構有明顯抑制作用，丹皮酚高劑量組心肌受損的改善程度與卡托普利組相當， 整體形態較為清晰。 見圖1。

圖 1 HE染色各組大鼠心肌結構變化 （ ×200）

2.3 Western-blot檢測 NF-κB-P65、 MMP9 的蛋 白表達 模型組 NF-κB-P65 的表達明顯高于假手術組 （ P＜0.01）， 丹皮酚低、 中、 高劑量組 NF-κB-P65 的表達顯著低于模型組（P＜0.05）， 卡托普利組 NF-κB-P65 的表達顯著低于模型組（P＜0.05） 見圖 2、 表 2; 模型組 MMP9 的表達明顯高于假手術組 （P＜0.05）， 丹皮酚中、 高劑量組 MMP9 的表達顯著低于模型組 （P＜0.05）， 卡托普利組 MMP9 的表達低于模型組 （P＜0.05） 見圖 3、 表 2。

圖 2 W estern-blot檢測各組大鼠心肌組織 NF-κBp65 的蛋白表達

圖 3 W estern-b lot檢測各組大鼠心 肌組織MM P-9 的蛋白表達

表 2 W estern-blot檢 測 各 組 大 鼠 心 肌 組 織 NF-κBp65、MMP-9 的蛋白表達 （， n=5）

表 2 W estern-blot檢 測 各 組 大 鼠 心 肌 組 織 NF-κBp65、MMP-9 的蛋白表達 （， n=5）

注: 與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01; 與模型組比較，#P＜0.05

組別 （ NF-κB/β-actin） （ MMP-9/β-actin）0.763 7 ±0.020 9 1.073 6 ±0.009 1模型組 1.177 9 ±0.042 4** 1.249 5 ±0.039 9*丹皮酚 低劑 量 1.086 6 ±0.027 4# 1.223 5 ±0.025 6丹皮酚 中劑 量 1.007 6 ±0.017 9# 1.150 7 ±0.029 3#丹皮酚 高劑 量 0.839 1 ±0.020 8# 1.094 9 ±0.044 4#卡托普 利 0.774 8 ±0.019 2# 1.112 1 ±0.036 7假手術組#

3 討論

急性心肌梗死后，心室發生進行性擴張和外形改變，稱為梗死后的 “心室重構”， 是急性心肌梗死后發生慢性心力衰竭的主要病理基礎。心室重構包括心肌細胞的變化和細胞外基質的變化，心肌細胞外基質的纖維膠原蛋白合成和降解之間的動態失衡在心臟重構過程中的作用十分重要，心梗后這種平衡被打破，引起心肌間質纖維化，限制心肌活動，引起心室順應性降低和心肌收縮力下降，進一步可發展為心力衰竭。同時膠原沉積還可減慢除極波通過心肌的速度， 使心肌組織電穩定性遭到破壞， 引起心律失常［5］。

MMP是一組 Zn2+依賴的內切蛋白水解酶家族， 參與細胞外基質的降解和膠原合成的調節［6］。 大量的研究證明，在心肌梗死的心室重構期， MMP2、 MMP9 的表達及活性持續性的升高［7］。 目前認為 MMPs可能介入了心肌梗死后心室重縮過程的幾個方面， 包括早期 ECM的降解， 新合成的結締組織的重縮，炎細胞和纖維母細胞的遷移，血管的生成， 促進膠原沉積和纖維化［8］。 本實驗中， 各組大鼠實驗前體質量無差異，4周后，模型組大鼠心質量較假手術組增加， 其心/體比明顯升高， 表明心梗后有心室重構的發生，心/體比增加可能與心肌細胞肥大、 纖維細胞增生、 膠原沉積及心肌細胞間質纖維化相關。蛋白印跡雜交試驗進一步顯示， 模型組大鼠心肌細胞中 MMP9蛋白水平明顯的高于假手術組 （P＜0.05）， 本實驗結果與以往的實驗研究結果一致， 心梗后心室重構的過程中 MMP9 的活性和表達持續升高。

本實驗結果還顯示丹皮酚低、中、高劑量處理組的大鼠心質量和心/體比， 較模型組明顯降低; 大鼠心肌細胞的MMP9蛋白表達水平明顯的低于模型組， 提示丹皮酚可能通過抑制 MMP-9 的表達， 降低了 ECM 的降解， 減少了心肌正常膠原網絡的破壞，從而緩解心梗后室壁的變薄及左室擴張的趨勢，改善心梗后的心室重構。

NF-κB是一種分布和作用十分廣泛的核轉錄因子， 它能夠與特異基因啟動子或增強子區域特定序列結合，啟動該基因的轉錄。 正常情況下， NF-κB與 IκB結合組成無活性的異源復合體存在于細胞質中，在細胞外刺激信號的作用下， IκB發生磷酸化， 磷酸化的 IκB再被泛素化后在 26 S蛋白酶作用下， 釋放 NF-κB P50/P65 進入細胞核， 與靶基因上的 κB位點結合并導致該處 DNA發生構象變化， 從而啟動或增強靶基因轉錄［9］。 通過對 MMP-9 基因結構分析發現， MMP-9 基因啟動子序列-670—-599 為 NF-κB P65 的 結合位點， 當 κB P65 與 之 結 合 將 誘 導 MMP-9 基 因 轉 錄［10］。腫瘤細胞侵襲試驗發現 NF-κB高度激活伴隨 MMP-9 的高表達，是細胞外基質降解的主要調控機制。

炎癥的激活是引起心室重構的主要因素， NF-κB是促炎癥基因表達的樞紐之一。心肌梗死期，局部缺血，氧供應不足，線粒體內電子傳遞受阻，加之抗氧化酶活性降低，產生并積累大量活性氧 （ROS）， 較強的氧化應激狀態激活NF-κB， 進入細胞核， 調控促炎基因的表達， 如白細胞介素-1β （IL-1β）、 腫瘤壞死因子-α （TNF-α）， IL-1β、 TNF-α一方面可以直接激活 MMPs系統， 特別是 MMP-9 和 MMP-2來降解心肌細胞外基質的膠原纖維網，另一方面可以進一步促進 NF-κB的活化， 形成細胞因子激活的正反饋通路和惡性循環［11］。

本實驗結果顯示， 模型組大鼠心肌細胞 MMP-9 的水平升高與 NF-κB P65 呈正相關， 證明了在心室的膠原重縮中NF-κB參與了 MMP-9 的表達， 這一結果與以往的研究結果一致。本實驗結果還顯示丹皮酚處理組與卡拖普利處理組大鼠心肌細胞 NF-κB P65 水平與 MMP-9 同步降低， 且具有統計學意義。課題組前期研究結果證明丹皮酚可抑制高脂血清誘導的人臍靜脈內皮細胞 NF-κB的活化。

綜上所述，心肌梗死后導致心力衰竭的心室重構是一個多因素參與的復雜過程，其中包括神經內分泌的激活、氧化應激反應、慢性炎癥等，但殊途同歸，最終將通過激活 NF-κB調控 MMP-9 的表達， 從而參與心室重構， 提示只要阻斷 NF-κB—MMP9 通路， 將能夠逆轉心肌梗死后的心室重構。因而證實丹皮酚改善心梗后心室重構作用可能是通過抑制 NF-κB通路下調 MMP-9 的表達而實現的。

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R285.5

:B

1001-1528（2014）12-2599-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.035

2014-02-13

河北省自然科學基金項目 （C2011406009）; 河北省衛生廳項目 （20100137）

周曉慧 （1957—）， 女， 教授， 碩士生導師， 研究方向: 心血管藥理學。 E-mail:zxh5055@sina.com