星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化枇杷葉三萜酸提取工藝研究

柯仲成, 胡善慶, 方 超, 朱志平, 徐志遠(yuǎn)

（黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院制藥工程教研室, 安徽 黃山 245041）

星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化枇杷葉三萜酸提取工藝研究

柯仲成, 胡善慶, 方 超, 朱志平, 徐志遠(yuǎn)

（黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院制藥工程教研室, 安徽 黃山 245041）

目的 星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化枇杷葉中三萜酸的提取工藝。 方法 以乙醇體積分?jǐn)?shù)、 料液比和提取時間為自變量，三萜酸得率為因變量，通過自變量與因變量的二次響應(yīng)面的回歸擬合，優(yōu)化提取工藝并進(jìn)行預(yù)測分析。結(jié)果最佳提取工藝為 14.4 倍量 82%乙醇， 提取 2 次， 每次 155 min。 結(jié)論 星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選枇杷葉三萜酸的提取工藝，方法簡便，精度高，預(yù)測性優(yōu)。

枇杷葉、星點(diǎn)設(shè)計、三萜酸、提取工藝

枇杷葉為薔薇科植物枇杷 Eriobotrya japonica Lind 的干燥葉，為傳統(tǒng)中草藥，性寒味苦，具有止咳平喘，清肺和胃，降氣化痰的功效，其主要成分有三萜酸類、黃酮類、揮發(fā)油、多酚類等。其中三萜酸類成分主要有熊果酸、齊墩果酸、科羅索酸和山楂酸等，這些成分具有明顯的降血糖［1-2］、 抑制肺纖維化［3-4］和抗腫瘤［5-6］等藥理活性。

近年來，在中藥材提取工藝優(yōu)化上，主要有正交設(shè)計法和星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法兩種方法， 也能獲得較好的工藝參數(shù)。相對而言，正交設(shè)計的應(yīng)用更久、更為廣泛，但星點(diǎn)設(shè)計作為一種相對較新的方法，隨著研究的逐漸深入，在中藥提取等相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用也迅速增加。目前，已有正交設(shè)計考察枇杷葉總?cè)扑崽崛」に嚨难芯繄蟮溃?-8］， 尚未見采用星點(diǎn)設(shè)計—效應(yīng)面法優(yōu)化枇杷葉三萜酸的提取工藝研究。 本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法［9-12］優(yōu)化提取工藝參數(shù)，并與文獻(xiàn)報道的正交設(shè)計結(jié)果進(jìn)行比較，以期能獲得較高的枇杷葉三萜酸得率，以便能在藥品、保健品等領(lǐng)域有更好的開發(fā)應(yīng)用。

1 儀器與試藥

KQ-100VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器 （ 昆山超聲）; T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計 （北京普析）;GZX—MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 （上海博訊）;AUY220 分析天平 （日本島津）。

熊果酸對照品 （上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號110106）; 枇杷葉 （2013 年 5 月采自安徽歙縣漳潭）; 其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 三萜酸測定方法的建立

2.1.1 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取 4.7mg熊果酸對照品， 用甲醇溶解， 轉(zhuǎn)移至 100 mL量瓶中， 甲醇稀釋至刻度， 定容， 即得質(zhì)量濃度為 47 μg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2 樣品溶液的配制 稱取 10 g枇杷葉， 粗碎， 置于500 mL圓底燒瓶中， 乙醇回流提取， 合并濾液， 減壓回收至無醇味，石油醚脫脂，再用水飽和正丁醇萃取，濃縮，減壓干燥， 得枇杷葉提取物。 精密稱定 10 mg， 用適量甲醇溶解， 并轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中， 定容， 備用。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密移取質(zhì)量濃度為 47 μg/mL熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2 mL， 分別置于 6 個蒸發(fā)皿中， 80 ℃水浴揮干， 加 5%香草醛-冰醋酸0.4 mL， 加高氯酸 0.8 mL， 60 ℃水浴加熱 15 min， 冰浴冷卻后， 加冰醋酸 5.0 mL， 搖勻， 于 545 nm處測定吸光度［13］， 以進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)， 吸光度為縱坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 所得的回歸方程為 Y=0.013 9X+0.133 3， r= 0.999 1， 表明樣品在 9.4 ～47.0μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取 2.0 mL樣液 6 份， 分別加入質(zhì)量濃度為 9.4 μg/mL熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 1.0、 2.0、3.0 mL（各 2 份）， 按 “2.1.3” 項(xiàng)方法操作并測定吸光度， 計算得加樣回收率為 100.3%。

2.2 枇杷葉三萜酸提取工藝優(yōu)化

2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果 參考文獻(xiàn) ［14-15］ 并結(jié)合預(yù)試驗(yàn)可知，影響回流提取枇杷葉三萜酸的主要因素有:乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間和提取次數(shù)等。由于提取次數(shù)不是一個連續(xù)變量因素， 不易處理［16］， 故先將其固定為2。在效應(yīng)面設(shè)計思路的指導(dǎo)下，設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)、 料液比和提取時間等3個因素，并將每因素設(shè)置3個水平，分別用代碼值 -1.682、 0、 1.682 來表示。 代碼值所代表的實(shí)際操作值見表 1， 試驗(yàn)設(shè)計及相關(guān)結(jié)果見表 2。

表1 各因素與水平的代碼值與實(shí)際值對照

表2 星點(diǎn)設(shè)計及試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 數(shù)學(xué)模型擬合 利用 Design-Expert 7.1.3 軟件， 將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行效應(yīng)面分析， 以枇杷葉中三萜酸得率 （Y）為效應(yīng)值， 分別對 X1、 X2、 X3三個因素， 分別進(jìn)行二項(xiàng)式方程和多元線性方程擬合，發(fā)現(xiàn)利用二項(xiàng)式方程擬合較優(yōu)，得方程如下:

考慮其中有些為 t檢驗(yàn)不顯著項(xiàng)， 將其刪除， 得到二項(xiàng)式方程簡化式:

從表3中方差分析可知，除乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時間等3個因素各自對枇杷葉三萜酸得率有極顯著影響 （P＜0.01）， 料液比和提取時間的相互作用也對枇杷葉三萜酸得率有顯著的相互影響 （P＜0.05）。 而乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時間則無顯著的相互影響 （P＞ 0.05）。 因此， 該方程能比較準(zhǔn)確地闡述枇杷葉三萜酸隨各個因素的變化趨勢，具有很好的預(yù)測指導(dǎo)性。

2.2.3 提 取工藝優(yōu)化 和預(yù)測 利 用軟件 （ Design-Expert 7.1.3）， 按照二項(xiàng)式方程的數(shù)學(xué)模型， 繪制枇杷葉三萜酸得率 （Y） 與 X2、 X3等 2 個變量的三維效應(yīng)曲面圖及等高曲線， 見圖1。

利用此數(shù)學(xué)模型， 可以預(yù)測在最優(yōu)提取工藝 （14.38倍量的81.89%乙醇， 提取2 次， 每次2.59 h） 條件下， 回流提取枇杷葉三萜酸， 得率最大值為 3.45%。

表3 方差分析

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 以預(yù)測的最優(yōu)提取條件為基礎(chǔ)， 基于方便操作的原則， 將工藝條件微調(diào)為14.4 倍量82%乙醇， 提取 2 次， 每次 155 min， 進(jìn)行 3 次平行驗(yàn)證試驗(yàn)， 測定并計算枇杷葉三萜酸得率分別為 3.38%、 3.35%、 3.42%， 平均值為 3.38%， RSD為 3.5%。 說明所建立的數(shù)學(xué)模型具有可靠的預(yù)測性，所選工藝條件具有較高的重現(xiàn)性。

3 討論

雖然三萜酸具有降血脂、降血糖和抗腫瘤等作用，在枇杷葉中含有量較高，但對其提取工藝研究卻較少，且大部分都為利用正交原理篩選工藝參數(shù)。 根據(jù)參考文獻(xiàn) ［8］的最佳提取工藝 （以 6 倍量和 4 倍量的 80%乙醇提取兩次， 1.5 h/次）， 進(jìn)行了提取試驗(yàn)， 通過測定發(fā)現(xiàn)三萜酸平均得率為 3.16%， 稍低于本研究優(yōu)化的 3.38%， 有少許的差別 （RSD=6.96%）， 所以本研究的工藝參數(shù)雖可以獲得稍高的三萜酸得率，但在提取溶劑方面消耗較大。因而這兩種工藝參數(shù)各有優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際需要，選擇合適的提取條件。

圖 1 X2X3相互作用對 Y的三維效應(yīng)面和二維等高線曲線圖

一般而言， 采用非線性數(shù)學(xué)模型星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法，充分考慮各個因素之間的相互影響，可以提高預(yù)測性和準(zhǔn)確性，是被一些科研工作者認(rèn)為優(yōu)于正交設(shè)計的原因所在，其實(shí)并不盡然，其實(shí)正交設(shè)計如果在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)置合理的因素與水平，同樣也一定可以獲得很好的工藝參數(shù)和較優(yōu)的提取效果。

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R284.2

:B

1001-1528（2014）12-2618-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.041

2013-08-17

安徽省高校省級自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目 （KJ2014A242）; 國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項(xiàng)目 （201210375034）; 安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （1308085QH139）

柯仲成 （1981—）， 講師， 研究方向: 中藥新劑型。 E-mail:xiaoke1020@126.com