星點設計-效應面法優化百蕊草總黃酮提取工藝

蘭艷素, 李長江, 宋坤鵬, 管超建

（黃山學院化學化工學院, 安徽 黃山 245041）

星點設計-效應面法優化百蕊草總黃酮提取工藝

蘭艷素, 李長江, 宋坤鵬, 管超建

（黃山學院化學化工學院, 安徽 黃山 245041）

目的 利用響應面分析法對百蕊草總黃酮的提取工藝進行優化。方法 在單因素試驗基礎上，確定乙醇體積分數、 液料比、 提取時間為 3 個自變量， 總黃酮得率為因變量， 通過星點設計-響應面法優化總黃酮提取工藝條件， 并進行預測分析。 結果 液料比和提取時間對百蕊草總黃酮的提取影響極顯著， 最優提取工藝為 乙醇體積分數 70%，提取時間 40min， 液料比 20 ∶1 （ mL/g）。 在此條件下， 黃酮提取量達到 13.58mg/g。 結論 該方法合理、 簡便、 快速，可預測性較優。

百蕊草;總黃酮;星點設計;響應面法

百蕊草為檀香科植物百蕊草 Thesium chinensis Turcz.的全草［1］， 又叫百乳草、 細須草、 地石榴等［2］， 多生于沙地草叢中或石坎邊，我國南北各省區等地均有分布，而且產量較高［3］。 百蕊草最早載于 《 圖經本草》， 味微澀苦， 性溫， 常被稱為 “ 植物抗生素”［4-5］， 是 我 國 民 間 常 用 中 藥。具有很好的抗菌、消炎、解熱、鎮痛以及補氣益腎等作用［6-7］， 臨床上 經 常 用 于 治 療 急 性 乳 腺 炎、 腎虛腰痛、 肺炎、乳癰、遺精、肺膿瘍、黃疸、扁桃體炎以及各種上呼吸道感染等病癥［8-10］。

百蕊草中含有的化學成分有黃酮、多糖、苷類、生物堿及礦質元素等， 其中黃酮類化合物的量最為豐富［11］。 到目前為止， 已經從百蕊草中分離得到 10 個黃酮類化合物［3，12］， 且所含的黃酮類化合 物 具有較好 的 抗 菌、 消炎活性［13］。 因此， 對百蕊草中總黃酮的研究具有重大意義。

本實驗采用超聲波輔助提取百蕊草總黃酮，在單因素試驗基礎上，以乙醇體積分數、液料比、提取時間為自變量，總黃酮得率為因變量，采用星點試驗設計，通過效應面法進行數據分析，優化百蕊草總黃酮的提取工藝，以期為百蕊草的進一步開發利用提供參考依據。

1 材料與儀器

1.1 材料 百蕊草產于安徽， 購于亳州萬生中藥飲片有限公司， 批號 100601， 經生命與環境工程學院方建新老師鑒定為檀香科植物百蕊草的全草。 蘆丁對照品 （批號 10080-200707， 購于中國藥品生物制品檢定所）; 乙醇購自黃山酒精廠;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純;重蒸餾水自制。

1.2 儀器 UV-2100 型紫外可見分光光度計 （北京北分瑞利分析儀器有限公司）;KH-500B超聲波清洗器 （昆山禾創超聲儀器有限公司）;TG165 高速離心機 （長沙平凡儀器儀表有限公司）; 電子分析天平 （上海梅特勒-托利多儀器有限公司）;GZX-9030 MBE電熱鼓風干燥箱 （上海博迅實業有限公司醫療設備廠）;FW100 型高速萬能粉碎機 （天津市泰斯特儀器有限公司）。

2 方法

2.1 供試液的制備

2.1.1 蘆丁對照品溶液的制備 將蘆丁對照品置于真空干燥箱中， 在 105 ℃條件下干燥至恒定質量， 精密稱取 12.5 mg干燥后的蘆丁對照品于干凈燒杯中， 用 60%乙醇溶解，轉移至 50 mL量瓶中， 60%乙醇定容至刻度線， 搖勻即得蘆丁對照品溶液， 該溶液質量濃度為 0.25 mg/m L， 備用。

2.1.2 百蕊草總黃酮的提取 稱取干燥后的百蕊草粉末樣品 1.0 g， 在 100 mL圓底燒瓶中， 分別在一定的乙醇體積分數、提取時間、液料比條件下，采用超聲法輔助提取百蕊草總黃酮， 提取液冷卻， 離心機低速離心 10 m in 后， 移取上層清液5mL置于50mL量瓶中， 乙醇定容刻度線， 作為待測溶液。

2.2 總黃酮定量測定

2.2.1 標準曲線的制作 分別精密移取 0.25 mg/mL蘆丁對照品溶液 0.0、 0.5、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0 mL， 置于 25 mL量瓶中， 分別加 60%乙醇至 6 mL， 加入 5%亞硝酸鈉溶液 1.0 mL， 搖勻， 放置 6 min， 然后加入 10%硝酸鋁溶液 1.0mL， 搖勻后放置 6min， 再加 4%的氫氧化鈉溶液 10 m L， 最后用 60%乙醇溶液定容至刻度線， 搖勻， 放置 15 m in， 以空白液作參照， 在 510 nm波長處測定吸光度值［14］。 制作蘆丁標 準 工作曲線， 得 線性回歸 方 程:y= 10.107x+0.045 9， r2=0.999 7， 線性關系良好。

2.2.2 樣品中總黃酮量的測定 用移液管移取 5.0 mL待測液于25 mL量瓶中， 按 “2.2.1” 項下的操作方法， 分別加入亞硝酸鈉、 硝酸鋁和氫氧化鈉， 靜置 15 min 后在 510 nm處測定提取液的吸光度 A值， 由標準曲線方程計算得出樣品溶液的質量濃度，再計算出樣品中總黃酮的量。計算公式為: 樣品中總黃酮量 （以蘆丁計）

式中:Y為黃酮提取量 （mg/g）;A為吸光度;V為離心之后的上清液體積 （mL）;m為樣品質量 （g）。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 精密移取 0.25 mg/mL蘆丁對照品溶液 1.0mL于 25mL量瓶中， 按照 “2.2.1” 項下方法測定溶液在510 nm處的吸光度值。 結果 RSD為1.2% （n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取制備好的百蕊草提取液 1.0 mL，置于25 mL量瓶中， 按 “2.2.1” 項下方法操作， 顯色后每隔 15 min 測定溶液在 510 nm處的吸光度值。 實驗結果顯示， RSD為 1.1% （n=6）， 表明供試品溶液在 1.5 h 內穩定。

2.3.3 重復性試驗 移取制備好的百蕊草提取液 6 份， 每份 1 mL， 按照 “2.2.1” 項下方法測定溶液在 510 nm處的吸光度值， 結果 RSD為 1.0%， 表明方法重復性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗 精密量取已知總黃酮量的百蕊草提取液 6 份， 再分別加入 0.25 mg/mL蘆丁對照品溶液 1.0 mL， 按照 “2.2.1” 項下方法測定溶液在 510 nm處的吸光度值， 計算回收率， 平均回收率為 99.9%， RSD為 1.1%。

2.4 單因素試驗

2.4.1 稱取百蕊草粗粉 6 份， 每份1.0 g， 分別加入20mL體積分數分別為 40%、 50%、 60%、 70%、 80%和 90%的乙醇溶液， 在溫度為 60 ℃條件下提取 30 min， 提取液按“2.2.1” 項下的操作方法顯色后測定溶液吸光度值， 并計算總黃酮量。

2.4.2 稱取百蕊草粗粉 5 份， 每份 1.0 g， 分別加入 70%乙醇溶液 20 mL， 溫度為 60 ℃條件下分別提取 20、 30、40、 50 和 60 min， 提取液按 “2.2.1” 項下的操作方法顯色后測定溶液吸光度值，并計算總黃酮量。

2.4.3 稱取百蕊草粗粉 5 份， 每份 1.0 g， 分別加入 10、15、 20、 25、 30、 35mL 70%乙醇溶液， 溫度為 60 ℃條件下提取 40 min， 提取液按 “2.2.1” 項下的操作方法顯色后測定吸光度值，并計算總黃酮量。

3 結果

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 乙醇體積分數對百蕊草總黃酮提取率的影響 由圖1可以看出，乙醇體積分數較低時，總黃酮的提取率很小，隨著乙醇體積分數的升高，總黃酮的提取率逐步增加，當乙醇體積分數為 70%時， 總黃酮的提取率達到最大值， 乙醇體積分數高于 70%時， 黃酮的量開始下降。 因此， 確定乙醇體積分數為 70%。

圖1 乙醇體積分數對黃酮提取率的影響

3.1.2 提取時間對百蕊草總黃酮提取率的影響 由圖 2 可知，提取時間很短時，黃酮得率較低，隨著提取時間的延長， 總黃酮提取量逐漸增加， 當提取時間為 40 min 時達到最大值。 40 min 后， 百蕊草總黃酮量趨于穩定， 故提取時間選取 40 min。

圖2 提取時間對黃酮提取率的影響

3.1.3 液料比對百蕊草總黃酮提取率的影響 由圖 3 可見， 當液料比為10∶1 時， 黃酮得量很低， 之后快速增加，在 15 ∶1 到 30 ∶1 之間變化時， 黃酮提取率的變化不大，當液料比為20 ∶1 時提取率達到最大值， 原因可能是溶劑量越多，藥材和溶劑的接觸越充分，提取量呈上升趨勢，但是當溶劑達到一定量之后，再增加溶劑的量，對提高黃酮得率也沒有太大幫助，由于加大溶劑的量，會提高提取的成本， 因此， 液料比選 20 ∶1。

圖3 液料比對黃酮提取率的影響

3.2 星點設計試驗

3.2.1 實驗設計與結果 在單因素試驗所得數據的基礎上，根據星點實驗設計原理，以百蕊草總黃酮得率為響應值，乙醇體積分數、液料比和提取時間為考察因素，分別用 X1、 X2、 X3表示， 每個因素設五水平， 并以 1.73、 1、0、 -1、 -1.73 表示自變量的高低水平， 各因素水平編碼見表 1。 星點實驗設計及結果見表 2。

表1 因素水平

表2 實驗設計與結果

3.2.2 模型擬合 以總黃酮提取率為響應值， 采用 Design Expert軟件對試驗結果進行回歸分析， 得到乙醇體積分數、提取時間和液料比對總黃酮提取率影響的二項式方程，擬合后，得到回歸模型方程為:

對該模型進行回歸方差分析和顯著性檢驗，結果見表3。

由表 3 可知， 該模型 P＜0.000 1， 表明實驗所得的回歸模型方程極顯著。在本實驗設定的區域范圍內，液料比和提取時間的 P值均小于 0.000 1， 對總黃酮得率的影響極顯著， 乙醇體積分數 P值小于 0.01， 影響顯著， 總的來說，各因素對響應值的影響順序為:液料比＞提取時間＞乙醇體積分數。

表3 響應面分析試驗方差分析結果

交互項中乙醇體積分數與提取時間的交互作用對總黃酮得率的影響極顯著，乙醇體積分數與液料比次之，液料比和提取時間的交互作用對總黃酮得率不明顯，即在提取過程中，總黃酮得率可以忍受液料比和提取時間的微小變化，而不至于產生較大的影響。二次項中均小于 0.000 1， 對響應值的影響都極顯著， 所以乙醇體積分數、液料比和提取時間對總黃酮提取率的影響并非簡單線性關系，而應該是二次曲線關系。

方程的失擬項 P值為 0.337 3， 失擬項不顯著， 說明其他未知因素對試驗結果的影響較小，擬合檢驗極顯著。所以，該方程與實際情況擬合很好，能夠較好地反映百蕊草總黃酮提取率與乙醇體積分數、液料比、提取時間的關系，可對百蕊草總黃酮的提取工藝參數進行較好預測。

3.2.3 效應面優化和預測 根據回歸方程， 利用 Design-Expert軟件， 繪制得到交互作用影響比較顯著的三維效應曲面， 見圖 4、 圖 5。

圖4 提取時間與乙醇體積分數交互影響黃酮得率的響應面圖

由圖4可見，當液料比一定，乙醇體積分數與提取時間的交互作用影響顯著，隨著提取時間延長和乙醇體積分數的增大，總黃酮提取率都呈現先增加后減少的趨勢，而且乙醇體積分數在 60% ～80%之間變化時， 總黃酮得率的變化范圍較大，即乙醇體積分數對總黃酮得率的影響比液料比大。

圖5 液料比與乙醇體積分數交互影響黃酮得率的響應面圖

由圖5可見，液料比與乙醇體積分數的交互作用影響曲面開口往下，曲面較陡峭，影響顯著。總黃酮得率隨著乙醇體積分數、液料比的增大而增加，并分別在液料比為20 ∶1 （m L/g）、 乙醇體積分數為 70%附近出現最高點， 之后開始降低，且乙醇體積分數降低的程度更大一點，說明乙醇體積分數對響應值的影響比液料比強。

總體來看，乙醇體積分數是3個因素當中對總黃酮提取率的影響最顯著。對回歸模型進行分析，黃酮提取率最大預測值為 13.58mg/g， 最優提取工藝條件為: 乙醇體積分數 70.19%， 提 取 時 間 42.10 min， 液 料 比 18.83 ∶1（mL/g）。

3.3 驗證試驗 為了檢驗該模型的準確度， 對模型優化得到的最優工藝結果做驗證性試驗，從具體操作條件來考慮，將工藝條件修正為乙醇體積分數 70%， 提取時間 40 min，液料比 20 ∶1 （mL/g）， 在該條件下， 做 5 次平行試驗。 驗證試驗測得總黃酮的平均得率為 13.76 mg/g， 相對誤差1.6%， 與預測值基本一致， 說明該模型與實際試驗點擬合較好，模型方程可靠、實用。因此，基于星點設計所得的最佳工藝參數準確可靠，具有實用價值。

4 討論

正交設計法、均勻設計法經常被應用于中藥有效成分的提取工藝研究，雖然以上兩種方法的試驗次數少，但在設定的實驗區域內，很難找到一個明確的函數式來表達各因素和響應值之間的關系，所以也就無法找到整個區域上考察因素的最佳組合，并對響應值的最優值進行預測。星點設計-響應面優化法可以彌補以上不足， 采用非線性數學模型擬合，并在中心點進行重復性試驗，可以提高實驗精確度。 所以實驗采用星點設計-響應面優化法對百蕊草總黃酮提取工藝進行了研究，該法簡便、穩定。

本實驗在單因素試驗基礎上，以乙醇體積分數、提取時間、液料比為自變量，總黃酮得率為因變量，采用星點試驗設計，效應面法進行分析，得到超聲波法輔助提取百蕊草總黃酮的最佳工藝條件為 70%乙醇提取， 提取時間40 min， 液料比 20 ∶1 （ m L/g）， 此條件下總 黃酮得 率為13.58 mg/g。

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R284.2

:B

1001-1528（2014）12-2629-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.044

2013-10-23

安徽高校省級優秀青年人才基金重點項目 （2013SQRL088ZD）; 安徽省高校省級自然科學研究項目 （KJ2011B168）; 黃山學院自然科學基金項目 （2011xkj017）

蘭艷素 （1985—）， 女， 碩士， 助教， 從事天然產物提取分離與活性研究。 Tel:13685595775， E-mail:ls7536858@163.com