龍葵多糖對 CCl4致急性肝損傷小鼠的保護作用研究

楊 云, 胡筱希, 周凌凌, 高書林, 丁 霞

（南京農業大學理學院, 江蘇 南京 210095）

龍葵多糖對 CCl4致急性肝損傷小鼠的保護作用研究

楊 云, 胡筱希, 周凌凌, 高書林, 丁 霞*

（南京農業大學理學院, 江蘇 南京 210095）

目的 研究龍葵多糖 （ water-soluble polysaccharides from Solanum nigrum L.） 對四氯化碳 （ CCl4） 致急性肝損傷小鼠的保護作用。 方法 采用 CCl4誘導小鼠急性肝損傷模型， 連續給藥 7d 后， 收集小鼠血清及肝組織標本， 測定血清中谷丙轉氨酶 （ ALT）、 谷草轉氨酶 （ AST） 和堿性磷酸酶 （ALP） 的活性; 檢測肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）、 過氧化氫酶 （CAT） 和谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-Px） 以及丙二醛 （ MDA） 的水平; 計算肝臟指數并同時對肝組織進行病理學檢查。 結果 多糖高、 中劑量顯著性抑制 CCl4所致急性肝損傷小鼠血清中 ALT、 AST和 ALP活性的升高 （P＜0.01）， 顯著性降低肝組織中 MDA的水平 （ P＜0.01）， 并顯著性升高 SOD、 GSH-Px和 CAT的活力（P＜0.01）。 肝組織病理切片顯示， 多糖一定程度減輕肝臟組織病理性改變。 結論 龍葵多糖對 CCl4造成的急性肝損傷小鼠具有顯著的保護作用，其保護機制可能與清除自由基，抑制脂質過氧化有關。

龍葵多糖; 保肝; 四氯化碳 （CCl4）; 急性肝損傷

龍葵 Solanum nigrum L.為茄科茄屬草本植物， 一年至 多年生， 幾乎遍布于全國 各地。 龍葵全草 皆可入 藥， 其性寒，味苦、微甘，亦有小毒，歸肺、腎經。具有清熱解毒、利水消腫以及活血化瘀的功效［1］。 臨床上龍葵主要是與其他一些中藥配伍用于治療肝癌［2］、 晚期胃癌［3］、 肺癌［4］等癌癥，療效確切。在中醫治療慢性乙型肝炎的復方中，龍葵也是經常被用到的一味藥材。龍葵全草含有生物堿、皂苷、多糖、維生素 A類、 維生素 C、酚類化合物等化學成分［5-6］。

多糖是一種非常重要的信息分子的受體，廣泛存在于生物有機體內，它參與一些關鍵過程的調節，如分子的識別、細胞的黏附以及機體的防御等。現有的研究成果證實多糖具有多種多樣的藥理活性，如調節免疫、抗腫瘤、抗病毒以及降血糖等［7-8］。 多糖顯示了極為廣闊的開發應用前景，引起了人們越來越大的興趣，現在多糖已經成為了保健品和天然藥物研發中的重要部分。

文獻報道龍葵的水提取物對四氯化碳誘導的肝損傷大鼠和硫代乙酰胺 （ thioacetamide， TAA） 誘導的肝纖維化小鼠均有顯著的保護作用，然而其保肝活性的物質基礎仍不明確［9-10］。 多糖是水提取物 中的主要成分 之 一， 通 過前期的實 驗 發 現， 龍 葵 水 溶 性 多 糖 （ water-soluble polysaccharides from Solanum nigrum L.） 有顯著的保肝活性， 所以本實驗進一步研究了龍葵水溶性多糖對 CCl4致急性肝損傷小鼠的保護作用并對其保肝機制進行了初步的研究，為龍葵多糖的開發應用提供重要的實驗依據。

1 材料

1.1 藥物和試劑 龍葵飲片 （批號 121114-1） 購于蘇州市天靈中藥飲片有限公司，經江蘇省中醫藥研究院鑒定為茄科茄屬植物龍葵 （ Solanum nigrum L.） 的全 草。 聯苯 雙酯滴丸， 北京協和藥廠生產， 批號 12060103; 龍葵多糖， 實驗室自制;四氯化碳購于南京化學試劑有限公司;谷丙轉氨酶 （ALT） 試劑盒、 谷草轉氨酶 （AST） 試劑盒、 堿性磷酸酶 （ALP） 試劑盒、 超氧化物歧化酶 （SOD） 試劑盒、過氧化氫酶 （CAT）、 谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-Px） 試劑盒、 丙二醛 （MDA） 試劑盒及考馬斯亮藍試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 動物 雄性 ICR小鼠， 體質量 （20 ±2） g， 清潔級，購于南京市江寧區湯山青龍山動物繁殖場，動物合格證號: SCXK （蘇） 2008-0009。

1.3 儀器與設備 電子天平 （美國雙杰兄弟有限公司）; T-6 新世紀紫外可見分光光度計 （北京普析通用儀器有限責任公司）; 低速離心機 （北京雷勃爾有限公司）;KQ-500超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）;RM2235 型石蠟切片機 （德國 Leica公司）;LEICA DM 1000 光學顯微鏡（德國 Leica公司）。

2 方法

2.1 龍葵多糖的制備 龍葵飲片粉碎成粗粉后， 用 80%乙醇加熱回流提取2次，過濾后得到龍葵殘渣。取干燥后的龍葵殘渣， 加 15 倍量的蒸餾水煎煮 2 次， 每次 4 h。 合并提取液， 減壓濃縮至適量體積， 加入 95%乙醇至最終乙醇體積分數為 80%， 4 ℃靜止過夜， 離心 （8 000 r/min），收集沉淀物。再將沉淀物溶解在適量的蒸餾水中，利用鹽酸法［11］除去粗多糖中大量的游離蛋白質， 大孔樹脂 D-900進行脫色后，乙醇沉淀、離心，收集沉淀物，并依次用無水乙醇、丙酮、乙醚抽洗，沉淀真空干燥，即得灰白色龍葵水溶性精制多糖。

2.2 CCl4誘導的小鼠急性肝損傷模型的建立 取 60 只雄性 ICR小鼠， 隨機分成 6 組， 每組 10 只， 分別為正常對照組，四氯化碳損傷模型組，龍葵多糖的低、中、高劑量組（100、 200、 400 mg/kg） 以及聯苯雙酯組 （150 mg/kg）。龍葵多糖和聯苯雙酯均用 0.5%CMCNa溶液混懸， 按 10 mL/kg體積灌胃給藥， 正常組及模型組給予等量的 CMCNa溶液， 每日一次， 連續7 d。 于末次給藥 2 h后， 除正常組外其余各組小鼠均腹腔注射 0.2%CCl4的橄欖油溶液 10 mL/kg。 禁食不禁水， 16 h 后， 摘眼球取血， 對小鼠予以脫臼處死，解剖取得肝臟。

2.3 生化指標的檢測與方法

2.3.1 肝臟指數的計算 用 4 ℃生理鹽水洗盡肝臟的殘血，除去表面結締組織，濾紙拭干后稱質量，按下式計算肝臟指數。

式中:m1為肝臟質量 （g）;m2為小鼠體質量 （g）。

2.3.2 血清及肝組織中相關酶活力的檢測 采集到的血樣在室 溫 放 置 2 h 后 ， 以 3 000 r/min 離 心 10 min 分 離 出 血清， 賴氏法測定血清中 ALT、 AST和 ALP的活性。 取0.2 g肝臟組織 ， 加冰生 理 鹽 水 1.8 m L， 制 備 10%的 組 織 勻 漿 ，以 3 000 r/min 離 心 10 min 后 取 上清液， 依照試劑 盒 說明書來測定 SOD、 CAT和 GSH-Px的活性以及 MDA的水平， 利用考馬斯亮藍比色法測定肝勻漿中總蛋白質的水平。

2.3.3 肝組織病理學檢查 取小鼠肝左葉大致相同部位的一小塊肝組織， 用 10%甲醛溶液固定后， 石蠟包埋， 切片（ 片厚 5 μm） ， 蘇木素-伊紅 （HE） 染 色， 然 后 在光鏡下觀察肝臟組織病理學改變。

2.4 統計學分析 實驗數據用 SPSS 16.0 軟件 處 理， 以（） 表示， 多 組數據間的 比較采用單因素方 差分析，P＜0.05 表示有顯著性差異。

3 結果與分析

3.1 龍葵多糖對急性肝損傷小鼠血清生化指標和肝臟指數的影響 模型組小鼠血清中 ALT、 AST和 ALP的活性較正常對照組明顯升高 （ P＜0.01）， 說明本次實驗模型造模成功。 龍葵多糖各劑量均能降低肝損傷小鼠血清中 ALT、AST和 ALP的活性， 高、 中劑量組與模型組比較均具有統計學差異，且高劑量組的降酶效果與聯苯雙酯組相當。模型組小鼠的肝臟指數顯著高于空白組 （P＜0.01）， 說明模型組小鼠肝臟發生腫脹。龍葵多糖的高、中劑量組能顯著降低由 CCl4升高的肝臟指數， 說明龍葵多糖對小鼠肝臟腫脹有一定的緩解作用，見表1。

3.2 龍葵多糖對急性肝損傷小鼠肝組織中 SOD、 GSH-Px、CAT的活性以及 MDA的水平的影響 與正常組比較， 模型組小鼠肝組織中 SOD、 GSH-Px和 CAT的活性顯著降低（P＜0.01， 0.001）， MDA水平顯著升高 （P＜0.01）， 說明本次實驗的小鼠急性肝損傷模型造模成功。與模型組比較， 龍葵多糖高、 中劑量均能升高肝組織中 SOD、 GSH-Px和 CAT的活性， 以及降低肝組織中 MDA的水平， 且差異具有統計學意義， 見表2。

表 1 龍葵多糖對急性肝損傷小鼠血清 AST、 ALT、 ALP和肝臟指數的影響 （， n=10）

表 1 龍葵多糖對急性肝損傷小鼠血清 AST、 ALT、 ALP和肝臟指數的影響 （， n=10）

注: 與正常對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。 下表同

組 別 劑量 /（ mg·kg-1） ALT/（ U·L-1） AST/（ U·L-1） ALP/（ U·L-1） 肝臟指 數 /% 47.96 ±7.65 85.80 ±12.51 51.26 ±7.24 4.84 ±0.63模型組 - 237.94 ±25.55## 250.59 ±27.46## 212.19 ±20.55## 5.84 ±0.85##龍葵多糖低劑量組 100 182.01 ±16.72* 215.96 ±20.29 170.84 ±25.39* 5.33 ±0.75龍葵多糖中劑量組 200 170.80 ±19.45** 178.23 ±22.08** 158.80 ±13.87* 5.21 ±0.45*龍葵多糖高劑量組 400 158.28 ±16.90** 163.88 ±17.73** 135.39 ±16.09** 5.02 ±0.48**聯苯雙酯組 150 149.98 ±16.61** 159.63 ±15.24** 120.12 ±12.26** 4.99 ±0.52正常對照組-**

，n=10）表 2 龍葵多糖對急性肝損傷小鼠肝臟中 SOD，GSH-Px，CAT和 MDA水平的影響 （

，n=10）表 2 龍葵多糖對急性肝損傷小鼠肝臟中 SOD，GSH-Px，CAT和 MDA水平的影響 （

組 別 劑量 /（ mg·kg-1） SOD/（ U·mg-1） GSH-Px/（ U·mg-1） CAT/（ U·mg-1） MDA/（ nmol·mg-1）39.54 ±5.89 85.71 ±8.96 220.79 ±19.93 5.12 ±0.73模型組 - 14.26 ±2.17## 29.70 ±3.87## 133.99 ±18.81## 14.31 ±1.31##龍葵多糖低劑量組 100 17.37 ±3.64 34.95 ±6.30 135.38 ±17.93 11.19 ±1.65**龍葵多糖中劑量組 200 20.54 ±3.32** 39.25 ±3.82** 155.22 ±17.07** 8.48 ±1.14**龍葵多糖高劑量組 400 25.71 ±3.68** 50.27 ±5.13** 172.56 ±18.19** 7.75 ±0.57**聯苯雙酯組 150 28.02 ±5.30** 58.81 ±6.80** 182.32 ±10.29** 7.06 ±0.75正常對照組-**

3.3 龍葵多糖對急性肝損傷小鼠肝組織病理學的影響 病理切片結果表明，正常對照組小鼠的肝組織結構正常，肝細胞沒有變性、 壞死等病理性變化 （圖 1-A）。 模型組小鼠的肝組織結構明顯被破壞，大部分肝細胞出現渾濁腫脹，細胞質疏松化，肝細胞灶性或者片狀壞死以及伴炎性細胞浸潤等病理性改變 （圖 1-B）。 龍葵多糖高、 中劑量組小鼠的肝細胞壞死，變性以及炎性細胞浸潤等病變得到了很大程度的減輕 （圖 1-E， 1-F）， 表明龍葵多糖高、 中劑量具有較好的保護肝細胞作用， 見圖1。

4 討論

CCl4致肝損傷是經典的化學性肝損傷動物模型。 在CCl4致急性肝損傷動物模型中， 主要的肝損傷機制是脂質過氧化反應。 CCl4在體內一系列酶的作用下， 生成三氯甲基自由基 （ · CCl3） 、 二氯甲基自由基 （ · CCl2） 及 過 氧化甲基自由基 （ ·OOCCl3）。 產生的這些自由基會攻擊位于肝 細 胞 膜 上 的 多 不 飽 和 脂 肪 酸 （ polyunsaturated fatty acid）， 從而引發一系列脂質過氧化反應， 導致肝細胞膜通透性改變， 肝細胞內的 ALT和 AST等轉氨酶就會大量釋放到血液中，從而導致血清中這些酶的水平急劇上升。因此，血清中 ALT、 AST和 ALP的水平被廣泛用作于臨床診斷肝臟炎性損傷程度的敏感指標［12］。

肝細胞損傷是很多種肝臟疾病共有的病理基礎，其中氧化應激過程在肝細胞損傷中占有很重要的地位。因而，對氧化應激導致肝細胞損傷的科學研究便成為治療肝臟疾病的重要途徑之一［13］。 SOD、 GSH-Px和 CAT是生物機體內重要的內源性抗氧化酶，它們分工或者合作共同抵御機體的外源性或內生的氧化應激損傷。其活力降低之后將會造成機體抗氧化能力一定程度的下降，從而使自由基的清除出現障礙，這將導致自由基的堆積，最終一定程度損傷肝細胞。 MDA是脂質過氧化反應產生的終產物， 其水平的高低可以反映出體內脂質過氧化的程度。

圖 1 龍葵多糖對 CCl4致急性肝損傷小鼠肝臟病理改變的影響

實驗結果顯示， CCl4肝損傷模型組小鼠的肝組織出現嚴重的損傷，肝小葉結構有明顯的破壞，大量炎性細胞浸潤其中，大部分肝細胞出現渾濁腫脹等病理性改變，并且血清中 AST、 ALT和 ALP的活性也顯著升高。 龍葵多糖各劑量組小鼠肝細胞受損程度明顯減少， 血清中 AST、 ALT和 ALP的水平顯著低于 CCl4模型組， 且降酶效果具有劑量依賴性，表明龍葵多糖具有保護肝細胞膜，一定程度對抗肝損傷的作用。

此外， CCl4肝損傷模型組小鼠肝組織中 SOD、 GSH-Px和CAT的活性顯著降低， MDA的水平顯著上升， 說明細胞清除自由基的能力大幅降低，機體內脂質過氧化反應加快，受自由基攻擊的損傷程度增大。而龍葵多糖可顯著提高肝組織中 SOD、 GSH-Px和 CAT的水平， 降低 MDA的水平，表明龍葵多糖能夠提高機體清除自由基的能力，并且一定程度抑制脂質過氧化反應的發生。

龍葵多糖對 CCl4致急性肝損傷小鼠保護作用的研究，目前國內外尚未有報道。其對肝細胞的保護可能是通過保護細胞膜、清除自由基、抑制脂質過氧化反應來發揮作用的。

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R285.5

:B

1001-1528（2014）12-2602-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.036

2013-10-12

中央高校基本科研業務費專項基金 （KYZ201220）

楊 云 （1987—）， 男， 碩士， 研究方向: 中藥物質基礎。 E-mail:yuny-ok@126.com

*通信作者: 丁 霞 （1963 —） ， 女， 副教授， 碩士生導師， 研究方向: 中藥物質基礎。 E-mail:dingxianjau@126.com

日期:2014-01-26

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20140126.1452.003.html