采用離子交換吸附對蛹蟲草中蟲草素的提取研究

原晉波，趙 琳，董 超 *，史延茂，崔少飛

（1.河北工業大學 化工學院，天津 300100；2.河北省科學院生物研究所，河北 石家莊 050081）

蛹蟲草又名北冬蟲夏草、北蟲草，是我國名貴中藥材之一。蟲草素是蛹蟲草的主要活性成分，是一種真菌核苷抗生素，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、消炎等藥理作用[1-5]，由于蟲草素可以干擾細胞的DNA和RNA復制，所以在艾滋病治療方面也有一定的作用[6-7]。

在蛹蟲草中蟲草素的含量比較低，分子質量小，分離提純成本高。所以現在還沒有蟲草素單品作為藥物的應用。目前，國內外許多科研工作者對蟲草素的分離提純工藝進行了研究。大多數以索氏提取法、熱水浸提法，超聲波法以及超臨界萃取法等提取蟲草素[8-9]，但是從這些方法中得到的蟲草素或純度不高或生產成本高昂。為此，本實驗采用離子交換樹脂來達到進一步分離純化蟲草素的效果，高效液相色譜法[10-11]測定蟲草素含量，最終確定最佳工藝吸附條件。

首先對蛹蟲草中的蟲草素進行了粗提，然后采用不同的吸附介質對蟲草素進行了吸附實驗，篩選得到了較好的吸附材料陽離子交換樹脂001×16。根據吸附條件采用動力學模型描述了001×16對蟲草素的吸附過程，Langmiur等溫線和Freundlich 等溫線分別被用來描述此吸附系統吸附等溫線，其吸附能力和等溫線參數被估算，并對兩種擬合方式作了比較，為進一步的蟲草分離純化工藝研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草：河北省安國市中藥材市場；蟲草素標準品：上海融禾醫藥科技發展公司；甲醇（色譜級）：默克化工技術（上海）有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市永大化學試劑開發中心；弱陽離子樹脂724、122，強陽離子樹脂001×16、001×14，大孔吸附樹脂D113、CD180：安徽三星吸附材料有限公司；鹽酸（分析純）：石家莊市試劑廠；氫氧化鈉（分析純）：天津市大陸化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

L-2000日立高效液相色譜：天美科技有限公司；FD-27冷凍干燥機：北京德天佑科技發展有限公司；JY92-II超聲波破碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；OM-130GB智能鼓風干燥箱：歐邁（上海）科學儀器有限公司；Sartorius PB-10 pH計：浙江象牙縣石浦海天電子儀器廠；Sapphire C18色譜柱：美國Sepax technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 蟲草粗提液制備

市場采購的蛹蟲草置于60 ℃烘箱內處理2～3 h，然后粉碎過100目篩，得到均勻的蛹蟲草干粉。將水與蛹蟲草干粉按照比例20∶1（mL∶g）混合，常溫超聲2～3次[9]，濾紙過濾，收集濾液，定容，0.22 μm濾膜過濾，HPLC測定蟲草素含量。

1.3.2 液相色譜測定方法

L-2000高效液相色譜儀Sapphire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL；柱溫：27 ℃；流動相：體積分數為15%的甲醇；洗脫時間：35 min。

1.3.3 吸附介質的預處理

離子交換樹脂的預處理：用1 mol/L HCl和NaOH反復浸泡，用1 mol/L NaCl、HCl和NaOH溶液進行轉型，再用蒸餾水洗至中性，備用。

大孔吸附樹脂的預處理：用1 mol/L HCl和NaOH反復浸泡，用蒸餾水洗滌樹脂，再用體積分數為95%的乙醇浸泡樹脂6 h，用蒸餾水洗至無醇味，備用。

1.3.4 吸附介質的篩選

將處理好的吸附介質724、122、CD180、D113、001×14.5和001×16瀝干，分別稱取2 g瀝干樹脂與10 mL蟲草提取液加入三角瓶中，每組三個平行（下同）。測定吸附前后液體中蟲草素的含量，選擇吸附量最大的吸附介質。

1.3.5 介質吸附蟲草素的pH條件

選取介質后，分別調整液體的pH值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，測定上清液中蟲草素含量，得到最佳處理的pH條件。

1.3.6 靜態吸附動力學曲線

取1 g處理好的陽離子樹脂001×16，加入15 mL蟲草素提取液，分別在20 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min、270 min取上清液，測定液體中蟲草素含量，繪制動力學曲線。

采用偽一級和偽二級動力學模型對蟲草素在001×16樹脂上的吸附動力學曲線擬合。

1.3.7 吸附等溫線

蟲草素粗提液的質量濃度梯度為0.009 84 mg/mL、0.0295 mg/mL、0.049 2 mg/mL、0.070 mg/mL、0.088 9 mg/mL、0.1085mg/mL、0.1283mg/mL、0.1476mg/mL、0.1702mg/mL、0.201 mg/mL、0.254 mg/mL、0.306 mg/mL。

將處理好的瀝干樹脂0.5 g和不同濃度的蟲草素粗提液10 mL，分別在15 ℃、25 ℃、35 ℃靜態吸附3 h（根據動力吸附曲線選定），繪制吸附等溫線。

分別用Langmiur等溫線和Freundlich 等溫線[12-13]描述此吸附系統吸附等溫線，并估算其吸附能力和等溫線參數。

2 結果與分析

2.1 標準曲線回歸線性方程的建立

以蟲草素質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線見圖1。蟲草素的標準曲線回歸方程為y=257 33x－126 736（R2=0.999 7），線性范圍是蟲草素質量濃度10～320 μg/mL，此范圍內線性關系良好，在選定的色譜條件下蟲草素出峰時間在17 min左右。檢測結果蟲草素在蛹蟲草中的含量為1 035.7 μg/g，這與凌建亞等[9]的測量結果相似。

圖1 蟲草素標準曲線Fig.1 Standard curve of cordycepin

2.2 樹脂的選擇

根據蟲草素的結構分析，嘌呤環是強的吸電子基團，氨基上的電子向環內偏移，從而使得氨基帶部分正電荷，進行離子交換吸附時優先選擇陽離子交換樹脂。

計算吸附平衡時吸附量Qe方程式：

式中：Qe為吸附平衡時的吸附量，mg/g；Ce為吸附前蟲草素質量濃度，mg/mL；Ci為吸附后蟲草素質量濃度，mg/mL；M為吸附劑質量，g；V為蟲草素粗提液的體積，mL。

實驗也驗證陰離子交換樹脂對蟲草素基本不吸附（數據未給出），在pH值為5，溫度為25 ℃，轉速180 r/min，蟲草素質量質量濃度為0.052 mg/mL條件下，常用的幾種陽離子樹脂的吸附實驗結果見圖2。由圖2可知，樹脂001×16對蟲草的吸附量較大，蟲草素的離子交換分離純化中優先考慮樹脂的吸附量，這是樹脂選擇的關鍵性因素[14-15]，因此選擇此樹脂做進一步研究。

2.3 pH條件對吸附量的影響

pH能夠直接改變吸附劑表面吸附位點和吸附質離子的化學形態，從而影響吸附量。在pH值為5，溫度為25 ℃，轉速180 r/min，蟲草素質量質量濃度為0.052 mg/mL條件下，不同pH對吸附量的影響見圖3。由圖3可知，當溶液pH＞9時，吸附量急劇下降，是因為堿性增強時蟲草素的形態趨于中性分子，失去交換能力，且吸附位點的H+被中和而失去交換位點，最終導致低的吸附量降低；反之當pH值為4～9時，蟲草素的陽離子形態得以增多，吸附量增大；但當過酸時，H+濃度增加與蟲草素形成競爭吸附關系，吸附量減小。根據實驗結果，pH值為4時吸附量最大，因此選擇在此條件下研究動力學曲線和吸附等溫線。

圖2 不同型號樹脂的吸附能力Fig.2 Adsorption ability of different resins

圖3 不同pH條件下的吸附量Fig.3 Adsorption ability at different pH

2.4 靜態吸附動力學曲線

001×16樹脂對蟲草素的吸附動力學曲線如圖4所示。由圖4可知，隨這時間的延長，001×16樹脂對蟲草素的吸附量逐漸增加，0～30 min吸附量的增加顯著，180 min后隨時間的延長，蟲草素的吸附量不再增加，這說明001×16樹脂對蟲草素的吸附達到飽和。

為找到合適的動力學模型描述001×16樹脂對蟲草素的吸附過程[16]，在pH值為5，溫度為25 ℃，轉速180 r/min，蟲草素質量質量濃度為0.052 mg/mL條件下，樹脂001×16吸附蟲草素的偽一級和偽二級動力學參數見表1，吸附動力學曲線見圖4。分別采用偽一級和偽二級動力學模型對圖4吸附動力學曲線進行擬合，結果如圖5和表1所示，擬合方程分別為：

式中：Qe為吸附平衡時的吸附量，mg/g；Qt為時間t時的吸附量，mg/g；t為吸附時間，min。

式中：Qt為時間t時的吸附量，mg/g；t為吸附時間，min。

表1 001×16吸附蟲草素的偽一級和偽二級動力學參數Table 1 Kinetics fitting parameters of cordycepin adsorption onto 001×16 resin based on pseudo-first-order and pseudosecond-order

注：Qe，exp為實驗值；Qe，cal為計算值；Kf為偽一級動力學模型的速率常數；Ks為偽二級動力學模型的速率常數。

由圖5可知，t/Qt 對時間t作圖得到良好的線性關系，該樹脂吸附蟲草素的動力學數據與偽二級動力學模型有更好的相關性，且按偽二級動力學方程計算的Qe，cal值于實驗值Qe，exp非常接近，說明該樹脂吸附蟲草素的動力學行為更符合偽二級吸附動力學規律，由于偽二級動力學方程建立于化學反應的機理假設，一定程度上說明化學吸附反應對樹脂001×16吸附蟲草素的速率起到主要控制作用，其吸附起始的速率常數為h=16.69 μg/（g·min）。

圖4 001×16樹脂對蟲草素的吸附動力學曲線Fig.4 Kinetics plot of cordycepin sorption onto 001×16 resin

圖5 偽一級和偽二級動力學方程擬合001×16樹脂對蟲草素的動力學曲線Fig.5 Kinetics fitting plots of cordycepin sorption onto 0001×16 resin based on pseudo-first-order and pseudo-second-order

2.5 吸附等溫線

2.5.1 線性擬合

通過線性擬合和非線性擬合計算得到的等溫吸附參數對比見表2，吸附等溫線的線性擬合分別見圖6（c）及圖6（d）。根據擬合相關系數R2，在不同溫度條件下Langmuir（L）的R2均高于Freundlich（F）的R2且根據回歸平方和（regression square sum，RSS），L模型均低于F模型，說明用L模型描述此吸附等溫線更合適。

表2 不同溫度下線性擬合和非線性擬合吸附等溫線參數比較Table 2 Linear fitting and non-linear fitting adsorption isotherm parameters comparison at different temperature

2.5.2 非線性擬合

吸附等溫線的非線性擬合分別見圖6（A）及圖（B）。對于樹脂001×16對蟲草素的吸附等溫線，非線性擬合與線性擬合的擬合相關系數R2相近，但非線性擬合的RSS要遠低于線性擬合的RSS，意味著實驗數據被更好的表述，即由非線性擬合計算得到的等溫線參數更加準確。

線性擬合不能直接地關聯實驗原始數據點，計算所得的等溫線參數可能存在較大的誤差。在非線性擬合中RSS的計算關聯每一個原始實驗數據，誤差分析涉及范圍內的所有數據，而由非線性形式轉變到線性形式會導致實驗誤差失真。因此線性擬合和非線性擬合得到的方程對于最大吸附量Qm的預測有大的差異，在實驗過程中預測值也會不同。實際中絕大數等溫吸附曲線是非線性的，誤差分布也會在線性轉換中改變，不同的軸向設置也會較大程度的影響R2值，這些最終影響等溫線參數的確定；而選用非線性擬合，由如上原因所導致的誤差就會避免。這表明獲取等溫吸附參數，非線性擬合方法更加準確。

根據非線性擬合Langmiur方程，001×16樹脂對蛹蟲草提取液中蟲草素的吸附量在15 ℃、25 ℃、35 ℃時分別是1.296 33 mg/g、1.034 7 mg/g、0.775 56 mg/g，吸附量隨溫度升高而降低，表明此吸附過程是一個放熱過程，一定范圍內低溫有利于吸附，高溫會抑制吸附，這對蟲草素的進一步解吸提供思路。

圖6 等溫線的線性和非線性擬合曲線Fig.6 Linear fitting and nonlinear fitting curve of isotherm

3 結論

結果表明，蟲草素在001×16的陽離子交換劑上吸附最優，且吸附等溫線符合Langmuir 方程。001×16對蟲草素的吸附受pH值的影響較大。其最佳的靜態吸附工藝為溶液pH值為4.0，溫度15 ℃，吸附時間3 h。在此條件下蟲草素的吸附量可以達到1.296 33 mg/g。

研究發現，選擇001×16陽離子吸附作為蛹蟲草中的蟲草素分離提純的初步步驟，既提高了分離效率，又為蟲草素進一步的解析提供了思路，同時為后續的進一步純化提供了基礎。

[1]LEE S Y,DEBNATH T,KIM S K,et al.Anti-cancer effect and apoptosis induction of cordycepin through DR3 pathway in the human colonic cancer cell HT-29[J].Food Chem Toxicol,2013,60(9):439-447.

[2]YAO L H,LI C H,YAN W W,et al.Cordycepin decreases activity of hippocampal CA1 pyramidal neuron through membrane hyperpolarization[J].Neurosci Lett,2011,503(3):256-260.

[3]CHENG Z,HE W,ZHOU X,et al.Cordycepin protects against cerebral ischemia/reperfusion injuryin vivoandin vitro[J].Eur J Pharmacol,2011,664(1-3):20-28.

[4]FAN D D,WANG W,ZHONG J J.Enhancement of cordycepin production in submerged cultures ofCordyceps militarisby addition of ferrous sulfate[J].Biochem Eng J,2012,60(5):30-35.

[5]LEE J H,YOON J Y,MYOUNG H,et al.Anti-cancer effects of cordycepin on oral squamous cell carcinoma proliferation and apoptosis in vitro[J].J Cancer Ther,2011,47(Suppl.1):S75.

[6]RAMESH T,YOO S K,KIM S W,et al.Cordycepin (3′-deoxyadenosine) attenuates age-related oxidative stress and ameliorates antioxidantcapacity in rats[J].Exp Gerontol,2012,47(12):979-987.

[7]MEYER C U,SCHMIDTKE P,ZEPP F,et al.Cordycepin is an immunoregulatory active ingredient ofCordyceps sinensis[J].Am J Chinese Med,2008,36(5):967-980.

[8]LING J Y,ZHANG G Y,LIN J Q,et al.Supercritical fluid extraction of cordycepin and adenosine fromCordyceps kyushuensisand purification by high-speed counter-current chromatography[J].Sep Purif Technol,2009,66(3):625-629.

[9]凌建亞，孫迎節，呂 鵬，等.蟲草屬真菌中蟲草素的超聲波提取及其毛細管電泳測定[J].菌物系統，2002，21（3）：394-399.

[10]李學軍，都興范，王林美，等.蛹蟲草中蟲草素的提取及純化工藝研究[J].生物技術，2012，22（5）：75-78.

[11]裴軼琨.超聲波提取HPLC-UV 法測定人工蛹蟲草中8 種核苷類物質[J].中國釀造，2012，31（11）：163-166.

[12]WONG Y C,SZETO Y S,CHEUNG W H,et al.Adsorption of acid dyes on chitosan-equilibrium isotherm analyses[J].Process Biochem,2004,39(6):695-704.

[13]PROCTOR A,TORO-VAZQUEZ J F.The Freundlich isotherm in studying adsorption in oil processing[J].J Am Oil Chem Soc,1996,73(12):1627-1633.

[14]潘中華，貢成良，范雪峰.蠶蛹蟲草中蟲草素的提取及純化工藝研究[J].江蘇蠶業，2003，25（2）：13-15.

[15]李 剛，朱華李，毛先兵，等.蛹蟲草中蟲草素分離純化工藝研究進展[J].重慶中草藥研究，2006，49（1）：51-54，29.

[16]MALL I D,SRIVASTAVA V C,AGARWAL N K.Removal of Orange-G and Methyl Violet dyes by adsorption onto bagasse fly ash-kinetic study and equilibrium isotherm analyses[J].Dyes Pigments,2006,69(3):210-223.