產淀粉酶非釀酒酵母菌的篩選及產酶特性研究

徐亞男，劉秋萍，王 月，趙九洲，肖 婧，史學偉*

（石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832000）

淀粉酶是一類能夠催化α-D-吡喃葡糖基之間1-4糖苷鍵水解的酶類[1]，廣泛存在于動物、植物和微生物有機體中，作用于淀粉分子產生多種產物，包括糊精、低聚糖及單糖分子等。淀粉酶作為一種生物催化劑，與傳統的化學催化劑相比具有催化能力強、底物專一性高等優點[2]，已在各個行業中得到廣泛應用。在淀粉加工行業中，用酶法糖化制造葡萄糖，使糖純度高、收得率高[3]；用淀粉酶液化和麥芽糖化法制麥芽糖，節約糧食，提高得糖率；α-淀粉酶制造低聚異麥芽糖，不產生界限糊精，有利于過濾[4]；α-淀粉酶可將淀粉長鏈分子水解為短鏈分子[1]，制造淀粉黏合劑，可增大其固體含量，控制淀粉的黏度以適應紙箱行業的需要；在紡織工業中，通常采用分批浸入式和連續式的α-淀粉酶去漿；在臨床醫學分析和制藥工業上，耐酸性強的α-淀粉酶可作為助消化劑添加于消化藥中[5]；在面包制作中淀粉酶用于改善面包的質量風味、縮短發酵時間、節約用糖[6]；此外還廣泛用于造紙業和清潔劑工業等。鑒于淀粉酶是用途最廣和產量最大的酶這一現狀，選育出酶產量高且具有良好性能的淀粉酶產生菌有著重要的應用價值。

非釀酒酵母菌是一類自然存在于葡萄表皮、釀酒環境中，能分泌多種胞外酶，通過代謝和自溶提高發酵食品的感官特性，參與復雜風味物質形成的酵母菌[7]。本研究的目的是在新疆特色葡萄、蘋果及奶酪產品中，廣泛采集非釀酒酵母菌，以期從中找到產淀粉酶活性較高的菌株。通過對產淀粉酶菌株進行鑒定，對所產淀粉酶的性質進行初步研究，應用于新疆特色釀造發酵行業中，以期改善產品質量，為后期的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

樣品采自新疆蘋果園腐爛蘋果、新疆維吾爾族人自制奶酪、新疆葡萄產區葡萄表皮及土壤，分離純化、鑒定后選取生長力較好的非釀酒酵母菌株為試驗菌株。

1.1.2 培養基[8]

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基：葡萄糖2.0%，酵母提取物2.0%，蛋白胨2.0%，瓊脂2.0%，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

酵母膏胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培養基：葡萄糖2.0%，酵母提取物2.0%，蛋白胨2.0%，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

篩選培養基：酵母膏0.5%，蛋白胨1.0%，NaCl 1.0%，可溶性淀粉0.2%，瓊脂2.0%，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

種子培養基：酵母膏0.5%，蛋白胨1.0%，NaCl 1.0%，可溶性淀粉0.2%，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基：酵母膏0.2%，蛋白胨0.8%，可溶性淀粉1.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，K2HPO40.1%，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

試驗所用試劑及藥品均為分析純：新疆沃德生物公司。

1.2 儀器與設備

ES120型精密天平：上海力衡儀器儀表有限公司；SW-CJ-2D型超凈臺：上海尚道儀器設備有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養箱：上海申賢恒溫設備廠；BHWY-211型變頻恒溫搖床：常州諾基儀器有限公司；TGL-16型臺式高速離心機：金壇市城西麗華實驗儀器廠；W-201B型數顯恒溫水浴鍋：金壇市國旺實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離純化

樣品經破碎帶皮進行自然發酵，發酵啟動后以不同濃度梯度涂布于YPD培養基，28 ℃培養48 h后，多次分離劃線得到單菌落，接種于YEPD培養基28 ℃培養48 h后，甘油保存于-80 ℃冰箱。蘋果樣品編號為Ai，奶酪樣品編號為Nj，葡萄樣品編號為Yz。

1.3.2 26S rDNA基因PCR擴增

根據形態學特征選取生長力較好且具有代表性的菌株按陳杰等[9]的方法進行DNA提取及PCR擴增產物測序。

1.3.3 產酶菌株的篩選

菌懸液于37 ℃涂布于篩選培養基上培養24 h后加稀碘液，靜置5 min后即可見清晰的透明圈[10]，測量透明圈與菌落直徑選取較大的單菌落接種于種子培養基，搖床37 ℃振蕩培養24 h，5%接種量于發酵培養基，搖床37 ℃振蕩培養24 h。

1.3.4 粗酶液的制備

取發酵液于4 ℃、5 000 r/min 條件下離心5 min，上清液即為粗酶液。

1.3.5 淀粉酶活性測定

取離心后的發酵液0.2 mL與1 mL質量分數為1%的淀粉溶液于37 ℃水浴5 min后沸水浴5 min終止反應，加入1 mL 3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS），沸水浴5 min后迅速冷卻，10 mL定容，于波長540 nm處測定其吸光度值。以煮沸1%淀粉溶液為空白。酶活力單位定義[11]：在37 ℃，每分鐘生成1 μmol/L葡萄糖所用酶量為1個酶活單位（U）。酶活力計算公式如下：

式中：A為根據回歸方程計算得葡萄糖含量，mg；N為稀釋倍數；t為反應時間，min。

1.3.6 粗酶性質研究

（1）pH值對酶活的影響[12]

分別配制0.1 mol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液（pH 3.0～5.0）、醋酸緩沖溶液（pH 4.0～7.0）、Tris-HCl緩沖溶液（pH 6.0～9.0）、甘氨酸-NaOH緩沖溶液（pH 8.0～10.0），配制1%淀粉溶液作為酶活測定的反應底物，考察pH值對酶活的影響。

（2）pH穩定性研究

粗酶液分別與等量不同pH緩沖液混勻，置于4 ℃冰箱12 h后，調至最適pH測酶活，以最高酶活為100%，其他pH條件下為相對酶活，考察酶pH穩定性。

（3）溫度對酶活的影響[13]

控制水浴溫度，每10 ℃為一個梯度，溫度分別為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃[13]，水浴5 min后，測酶活，以確定最適反應溫度，考察溫度對酶活的影響。

（4）熱穩定性研究

粗酶液置于不同溫度水浴，30 min后迅速冷卻，測酶活，以最高酶活為100%，其他溫度條件下為相對酶活，考察酶的熱穩定性。

（5）金屬離子、抑制劑、螯合劑對酶活的影響[14]

反應體系中加1 mmol/L各種金屬離子溶液1 mL：Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+；抑制劑十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）；螯合劑乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），測酶活，以最高酶活為100%，其他金屬離子及抑制劑、螯合劑下為相對酶活，考察金屬離子、抑制劑、螯合劑對酶活的影響。

1.3.7 數據分析

獨立重復進行3次試驗，結果表示3次測定的平均值。

2 結果與分析

2.1 基于26S rDNA基因序列的酵母菌株系統發育分析

樣品菌株經分離純化后根據形態學特征，選取37株非釀酒酵母菌進行DNA提取及26S rDNA基因PCR擴增，所得序列提交NCBI，通過Blast工具在GenBank數據庫中與已發表的26S rDNA D1/D2區域序列進行同源性比較，構建系統發育樹，結果見圖1。

2.2 產酶菌株的篩選

將稀碘液滴入篩選培養基，觀察顏色變化和水解圈，篩選出11株產淀粉酶菌株。產酶菌株分別為A1、A2、A4、A5、N1、N8、N11、Y13、Y15、Y18、Y19。篩選結果見圖2。

由圖2可知，A2、A5、N11、Y13的水解圈的直徑與菌落直徑的比值較大，該比值與液體發酵產酶能力的高低并不成正比關系。因菌落周圍降解圈的大小除了與酶的活性有關外，還與菌株自身及酶所需的條件有關。因此，還需對酶進行酶學性質研究，以篩選出高產淀粉酶菌株。

圖1 基于26S rDNA序列的37株酵母菌株的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the 37 yeast strains based on 26S rDNA sequence

圖2 產酶菌株篩選結果Fig.2 Screening results of enzyme production

2.3 粗酶性質試驗結果

2.3.1 pH值對淀粉酶酶活性的影響

圖3 pH值對淀粉酶活性的影響Fig.3 Effect of pH on amylase activity

酶需要在一定的pH值、溫度和金屬離子存在下才能發揮作用。pH值影響酶的空間結構、底物與酶的結合、酶活性部位的構象，進而引起酶的構象改變，使結合后不能生成產物，影響酶的活性[15]。由圖3可知，在酶活定義37 ℃下測定酶活，隨著pH值的升高，各菌株淀粉酶酶活力增大，在pH 7.0～8.0時達到最高（Y19除外），pH繼續增加，則酶活力降低較大幅度。其中，Y19在pH值為9.0時酶活力達到最高，呈堿性。菌株A1、A2、A4、A5、Y13、Y15、Y18最適pH值為8.0，呈弱堿性；菌株N1、N8、N11最適pH值為7.0，呈中性。

2.3.2 pH值穩定性研究

圖4 淀粉酶的pH穩定性Fig.4 pH stability of amylase

不同的pH值會對酶的穩定性產生影響。通過對酶的pH值穩定性進行測定，可以找到能夠使酶保持相對穩定的pH值條件，以使酶達到最大酶活限度的充分利用，從而對酶進行貯藏或生產[16]。由圖4可知，各菌株在pH值為6.0時，酶活力均為最佳（Y15除外），在pH值為5.0時，Y15酶活力最佳。在pH 4.0～8.0范圍內，各菌株均可保持較好酶活力，在強酸pH值為3.0、強堿pH值為10.0時，酶活損失較嚴重，說明菌株不耐強酸強堿。在pH及其穩定性試驗中，N1菌株的產淀粉酶的酶活力最高，其他10株則相差不大。

2.3.3 溫度對淀粉酶活性的影響

酶促反應受溫度的影響：一方面，當溫度升高時，反應速率加快；另一方面，隨溫度的升高，酶蛋白變性逐漸失活，反應速率下降[17]。由圖5可知，在各菌株最適pH值作用下，隨著溫度的升高，各菌株的酶活力增大，在40 ℃時，各菌株均表現了最佳酶活力，隨著溫度繼續升高，酶活力降低。由此可以判定，40 ℃為該菌株所產淀粉酶的最適溫度。在此試驗中，Y13酶活力最高，略高于N1。其他菌株也表現出較小的差異。

圖5 溫度對淀粉酶活性的影響Fig.5 Effect of temperature on amylase activity

2.3.4 熱穩定性研究

圖6 淀粉酶的熱穩定性Fig.6 Thermal stability of amylase

熱穩定性是酶的重要屬性之一[18]，任何導致酶的空間結構變化的因素都會影響酶的熱穩定性。由圖6可知，在40 ℃時，各菌株均表現了最佳酶活力，在30～50 ℃時，各菌株保持了較高的酶活力。A5菌株在20 ℃和60 ℃時，酶活力損失較為嚴重，損失率分別為為88%和76%。

2.3.5 金屬離子、抑制劑、螯合劑對淀粉酶活性的影響

圖7 金屬離子、抑制劑、螯合劑對酶活力的影響Fig.7 Effect of metal ions,EDTA and SDS on amylase activity

在各菌株最適pH值、溫度條件下測酶活結果（圖7）可知，Fe2+和Cu2+對各菌株均有較高的激活作用，Fe2+的激活作用最大（Y18除外），Mg2+對Y18有較好的激活作用，其他幾種金屬離子均對淀粉酶有不同程度的抑制作用，SDS和EDTA均能抑制酶的活性，說明該酶的作用需要金屬離子的參與。

3 結論

在新疆葡萄產區葡萄表皮及土壤、腐爛蘋果及奶酪產品中廣泛采集樣品，分離出大量非釀酒酵母菌，對其中37株非釀酒酵母菌進行篩選，經過選擇性培養基，成功篩選出11株產淀粉酶酵母菌，酶學性質研究表明，該11株酵母菌在pH 7～9表現了較高的酶活力，在pH 5～6時保持穩定；最適反應溫度為40 ℃，在30～50 ℃時保持較高酶活力；金屬離子依賴性發現，Fe2+、Mg2+對酶有不同程度的激活作用，Ca2+、Ba2+、Cu2+對酶有抑制作用。SDS、EDTA對酶均有抑制作用，由于EDTA為金屬螯合劑，抑制酶活約為50%，可以推測，本試驗中酶對二價金屬離子具有一定的依賴作用。

在本試驗中，N1和Y13表現出較高的酶活力，N1采自奶酪，Y13采自新疆葡萄園區，蘋果樣品中產酶量相對較少。后期將針對高產淀粉酶菌株進行誘變及分離純化，對純酶進行酶學性質的研究。

目前新疆葡萄酒釀造主要以進口釀酒酵母為主，缺乏地域特色。后期研究工作的重點是將本試驗篩選高產淀粉酶誘變菌株進行擴大培養制備活性干酵母，與工業釀酒酵母混合發酵釀造葡萄酒，以期改善葡萄酒香氣、提高產品質量及設備利用率，同時利用新疆葡萄酒地域優勢[19]，提高產品競爭力。

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