利用Box-Behnken法優化黑木耳蘋果醋的酒精發酵工藝

黃賢剛，管 斌 *，魯 曾，胡曉文

（1.日照職業技術學院 海洋工程學院，山東 日照 276826；2.中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

黑木耳（Auricularia auricula）是一種藥食兩用大型真菌，富含膠質、磷脂和纖維素，具有潤肺、清腸等功能，其中的黑木耳多糖成分具有抗凝血、抗腫瘤、抗炎癥、降血糖、抗輻射等生理功能，具有極大的開發利用價值[1]。蘋果醋是以蘋果為主要原料，經酒精發酵和醋酸發酵而成，含有豐富的有機酸，開胃、促消化，能抑制體內氧化物的形成，具有抗疲勞、抗衰老等生理功用[2]。利用液體深層發酵后的黑木耳菌絲體和壓榨得到的蘋果汁，共同進行酒精發酵和醋酸發酵，再通過口味調配加工而成的黑木耳蘋果醋飲料，既最大限度地促進黑木耳和蘋果的合理開發利用，又集兩者的滋補功效和營養價值于一體，具有廣闊的市場前景[3-4]。本研究以濃縮蘋果汁和黑木耳菌絲體為原料，探討確定黑木耳蘋果醋飲料酒精發酵過程的工藝參數，通過單因素試驗對初始糖度、發酵溫度、pH值、酵母接種量等做出初步判斷，然后通過Box-Behnken試驗設計得到回歸模型并預測最大值，利用模型優化得到各因素共同作用下的最佳工藝條件并通過試驗驗證，為黑木耳蘋果醋飲料酒精發酵試驗及中試生產提供參考數據[5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃縮蘋果汁（可溶性固形物70.0%～72.0%，酸度0.7%，pH 3.6～4.4）、斜面培養基（2%瓊脂，麥芽汁10°Bx，pH6.4）：日照職業技術學院食品工程技術中心提供；酵母（BM45）：日照職業技術學院食品研究所提供；發酵的原料液：破壁勻漿的菌絲體與兩倍稀釋滅菌的濃縮蘋果汁以重量比9∶1混勻；白砂糖：市售；酵母浸膏（BR）：北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂（食品級）：東海瓊膠食品有限公司；葡萄糖（分析純）、檸檬酸（分析純）：上海埃彼化學試劑有限公司；乙醇（分析純）：天津登科化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備[6，9]

GHP-9080隔水恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；202-2A鼓風干燥箱：龍口先科儀器公司；YXQ-LS-50全自動高壓蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業有限公司；AR2140電子天平：美國奧豪斯公司；PHS-3C酸度計：上海雷磁儀器廠；7890A氣相色譜儀：配有FID檢測器自動進樣器，色譜柱HP-FFAP（30 m×0.25 mm×0.5 μm），安捷倫科技有限公司；糖度計：北科新宇公司；ZHWY-2102恒溫振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；磁力攪拌器：龍口先科儀器公司；SP-721E可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程[7]

1.3.2 初始糖度單因素試驗

分別將發酵原液初始糖度調至8°Bx、10 °Bx、12°Bx、14°Bx、16°Bx、18°Bx 6個梯度，再接入5%已活化的酵母液進行發酵，溫度控制在28 ℃，直到發酵過程停止。期間固定間隔時間測定發酵完畢后的酒精度和殘余糖度。

1.3.3 發酵溫度單因素試驗

原液中接入5%已活化的酵母液，置入培養箱中發酵，溫度分別控制在24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃5個梯度，直至酒精度上升緩慢，發酵停止。期間固定間隔時間測定發酵液的酒精度和殘余糖度。

1.3.4 pH單因素試驗

將調糖配置的發酵原液的pH值分別控制在3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，接入5%已活化的酵母液，置入培養箱中發酵，溫度控制在28 ℃，直至酒精度上升緩慢，發酵過程停止。期間定時測定發酵液的酒精度和殘余糖度。

1.3.5 接種量單因素試驗

分別向處理好的發酵原液中接入3%、4%、5%、6%、7%、8%已活化的酵母菌，置入培養箱發酵，溫度控制在28 ℃，直至酒精度上升緩慢，發酵活動停止。期間定時測定發酵液的酒精度和殘余糖度。

1.3.6 Box-Behnken試驗設計[8，12]

在單因素試驗結果基礎上，選擇初始糖度、發酵溫度、pH值、接種量4個因素，以酒精度（Y）為指標，利用Box-Behnken法，選取三個水平進行優化研究，建立數學模型進行3次平行試驗，進一步探求各因素共同作用下的最佳發酵條件。因素與水平編碼表見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

1.3.7 酒精發酵動態曲線

根據得到的最佳工藝參數，在28 ℃、pH值5.0條件下，將6%的酵母菌接入到初始糖度14.5°Bx的原料液中發酵，至殘余糖度和酒精度變化均不再明顯時結束。定時測定殘余糖度、酒精度變化情況。

1.3.8 測定方法

酒精度測定[9]：色譜法，柱溫50 ℃，氣化室和檢測器溫度240 ℃，載氣（高純氮）流量30 mL/min，氫氣流量30 mL/min，空氣流量：300 mL/min；可溶性固形物測定：糖度計；總糖測定：GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.3.9 數據處理方法

單因素試驗通過3平行試驗取平均值。根據單因素試驗結果，利用Design-Expert 8.05軟件設計4因素3平分析試驗，并對結果數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 初始糖度對黑木耳蘋果醋飲料酒精發酵的影響[8]

圖1 初始糖度對酒精發酵的影響Fig.1 Effect of initial sugar content on alcohol fermentation

初始糖度對黑木耳蘋果醋飲料酒精發酵的影響見圖1。由圖1分析可知，隨著初始糖度的遞增，發酵完畢后料液中的酒精度呈上升趨勢。其主要原因是初始糖度較低時，可供酵母菌利用的糖分較少，不利于酒精發酵的進行；隨著初始糖度的增加，同等條件下酒精發酵作用進行明顯；初始糖度達到14°Bx以上時，發酵完畢后的酒精度增加無明顯變化，殘余糖度逐漸增多，這主要是因為發酵液中不斷增高的酒精度對酵母菌生長有所抑制，初始投入的糖原料不能充分利用。因此，初始糖度以14°Bx較適宜。

2.2 發酵溫度對黑木耳蘋果醋飲料酒精發酵的影響

發酵溫度對黑木耳蘋果醋飲料酒精發酵的影響見圖2。由圖2分析可知，酒精度隨著溫度的升高不斷增大，28 ℃時酒精度最大，酒精發酵效果較好，這說明溫度影響酵母菌的細胞活力；超過28 ℃后，隨著溫度的升高，酒精度逐漸下降，這一方面可能是由于溫度過高抑制了酵母菌的生長繁殖，另一方面可能由于溫度的升高造成部分酒精的揮發，從而使得酒精度值變小。因此，選擇28 ℃發酵溫度較適宜。

圖2 發酵溫度對酒精發酵的影響Fig.2 Effect of temperature on alcohol fermentation

2.3 pH值對黑木耳蘋果醋飲料酒精發酵的影響

圖3 pH值對酒精發酵的影響Fig.3 Effect of pH on alcohol fermentation

pH值對黑木耳蘋果醋飲料酒精發酵的影響見圖3。從圖3可以看出，當pH值為3.5～5.0時，酒精度不斷增加且迅速，pH值為5.0時酒精度達到最大；當pH值＞5.0后，發酵液的酒精度呈下降趨勢。這說明酵母菌的酒精發酵作用受到溶液酸堿度的影響，在發酵過程中，發酵液的pH值會隨著微生物的生長和代謝而不斷變化，可能會偏離酵母菌適宜生長或者產物累積的pH值。因此，pH值初定在5.0。

2.4 接種量對黑木耳蘋果醋飲料酒精發酵的影響

圖4 接種量對酒精發酵的影響Fig.4 Effect of inoculum on alcohol fermentation

接種量對黑木耳蘋果醋飲料酒精發酵的影響見圖4。由圖4分析可知，酵母菌接種量為5%時，酒精度達到最大。其中原因主要是由于接種量過小造成了酵母菌自身繁殖消耗過多，而用于發酵的消耗較少；接種量超過一定值也會增加酵母菌用于生長的消耗，從而造成酒精度的下降。

2.5 Box-Behnken試驗設計

按照響應面設計方案，安排了29組試驗組合，每組3次平行試驗發酵結束時分別測定其酒精度取平均值[10]，結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗結果與分析Table 2 Result and analysis of Box-Behnken experiment

利用Design-Expert 8.05軟件，以酒精度為響應值，對表2進行多元回歸擬合，得到工藝參數初步回歸模型：

模型的方差分析結果如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Behnken experiment

從表3可知，模型（1）的F值為39.92，P值＜0.000 1，說明該模型具有高度顯著性，模型擬合度較好，能對酒精度進行分析和預測；失擬項P=0.131 8＞0.05，影響不顯著，表明回歸模型與實測值能較好地擬合，可以用此模型對黑木耳蘋果醋酒精發酵階段的酒精度進行分析和預測。

由回歸方程各變量的系數顯著性檢驗可知，模型的一次項A、C、D影響極顯著（P＜0.01），B影響不顯著（P＞0.05）；二次項A2、B2、C2、D2影響均極顯著（P＜0.01）；交互項AD影響極顯著（P＜0.01），BC影響顯著（P＜0.05），AB、AC、BD、CD影響不顯著（P＞0.05）。依據方程各變量系數的大小可知，初始糖度、接種量對酒精度影響最大，其次pH值，最后是發酵溫度。

剔除不顯著項，經優化后回歸模型為：

對回歸方程（2）進行方差分析，結果表明，模型各項檢測數據均達到理想指標，其中決定系數R2為0.966 2，說明96%的試驗數據可用這個方程解釋[11-12]。

2.6 響應面分析

在交互項中，初始糖度（A）和接種量（D）的交互作用影響極顯著，發酵溫度（B）和pH值（C）的交互作用影響顯著[13]。利用Design-Expert 8.05軟件繪出兩者相應的響應面圖和等高線圖[14]，如圖5、圖6所示。

圖5 初始糖度(A)和接種量(D)的交互作用對酒精度影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface and contour plots of the interaction effect between initial sugar content (A) and inoculum (D) on alcohol content in fermentation

圖6 發酵溫度(B)和pH值(C)的交互作用對酒精度影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface and contour plots of the interaction effect between temperature (B) and pH(C) on alcohol contect in fermentation

從圖5可知，在發酵溫度28 ℃、pH值為5.0情況下，當初始糖度較低時，酒精度隨著初始糖度的增加而不斷上升，但當初始糖度超過14°Bx后，酒精度隨著初始糖度的增加而降低，酒精度呈拋物線變化。接種量在初始糖度較低時，對酒精度的影響不大，隨著初始糖度的增加，對酒精度的影響逐漸明顯，但當初始糖度超過14°Bx后，對酒精度的影響又趨于平緩。這主要是接種量過小時酵母菌自身消耗多，過多時也會增加自身用于生長的消耗，和單因素試驗結果吻合。在初始糖度13～15°Bx和接種量4%～6%范圍內，酒精度可以達到試驗最大值。

由圖6可知，在初始糖度14°Bx、接種量5%的情況下，隨著發酵溫度的升高，酒精度呈拋物線狀態。pH值則在較低和較高時，對酒精度的影響不明顯，這主要因為發酵液的pH值會隨著微生物的生長和代謝而不斷變化，對酒精度的生成有所影響。在發酵溫度27～29 ℃和pH 4.5～5.5范圍內，酒精度可以達到試驗最大值。

在試驗結果分析及模型擬合的基礎上，利用軟件分析計算得到回歸方程的最大值，即在初始糖度14.42°Bx、發酵溫度28.01 ℃、pH值5.13、接種量6%時，預測最大值為6.72%vol。根據試驗條件和實際操作方便性，將工藝條件修正為初始糖度14.5 °Bx、發酵溫度28 ℃、pH值5.0、接種量6%時，發酵7 d，進行3次平行試驗驗證，得到的酒精度平均值為6.63%vol，接近預測值，說明模型較為準確，對于黑木耳蘋果醋酒精發酵條件的研究具有指導意義[15]。

2.7 黑木耳蘋果醋酒精發酵的動態曲線

將得到的試驗結果繪制成曲線，見圖7。

圖7 酒精發酵動態變化曲線Fig.7 Dynamic curve of alcohol fermentation

從圖7可知，在整個發酵過程中，殘余糖度隨時間的延續不斷下降，而酒精度則呈上升趨勢[16]。前2天，糖度持續下降，但酒精度的變化趨勢稍緩慢，這主要是發酵初期，酵母菌仍處于有氧期，菌體繁殖較快但發酵作用較緩慢；第3天，發酵作用逐漸增強，伴隨產生大量氣泡，酒精味道變得愈來愈濃重，這段時間為發酵主要時期，溫度、pH值等條件適宜，酵母菌處于無氧條件，發酵作用持續增強，酒精度上升明顯，殘余糖度快速下降；第6天后，酒精度和殘余糖度的變化趨于平緩，不斷有產物沉淀，酒精含量累積到最大，糖的消耗量降至最低，此時由于發酵液中一些酵母菌菌體代謝消耗，加上較高濃度的酒精對酵母的生長發酵活動的抑制作用，發酵過程趨于緩和；第7天，糖分參與發酵轉化過程基本完成，酒精度也基本達到最大值，不再上升，此時發酵過程結束。因此，發酵時間選擇7d為宜。

3 結論

通過試驗及數據分析，確定了黑木耳蘋果醋酒精發酵過程的最佳工藝參數組合：初始糖度14.5°Bx，發酵溫度28 ℃，pH值5.0，接種量6%，發酵時間7d，通過試驗進行驗證，此時的酒精度可達到6.63%vol，與預測值接近。這些參數的獲取和模型的建立為黑木耳蘋果醋酒精發酵的實際生產提供了參考數據，具有較強的實踐指導意義。

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