發芽大豆固態發酵功能紅曲產Monacolin K工藝技術研究

黃 勛，王常蘇，高澤鑫，高 冰*

（1.武漢生物工程學院 生物科學與技術系，湖北 武漢 430415；2.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；3.湖北工業大學 輕工學部，湖北 武漢 430068）

紅曲霉作為發酵食品使用菌在我國已有上千年的使用歷史，應用于食品著色和藥用。自20世紀70年代末，日本ENDO A[1]發現紅曲霉代謝產物中Monacolin K具有降膽固醇的功能，促進了紅曲霉的研究與應用。紅曲的次級代謝產物主要有紅曲色素、Monacolin K、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、桔霉素（citrinin）等，前三者已證明其具有重要的生理活性功能。紅曲色素作為食品著色劑廣泛應用于肉制品、釀酒制醋等[2]。Monacolin K作為膽固醇合成抑制劑，能減少體內膽固醇的合成，調節人體內異常血脂以及治療，是一種理想的降膽固醇和血脂藥物[3-6]，此外Monacolin K還具有預防心腦血管疾病、抗腫瘤、預防老年癡呆和降低中風風險以及對腎臟免疫調節等作用[7-8]。陳運中等[9]通過動物試驗證明了Monacolin K具有抗疲勞作用。GABA具有降血壓和預防老年癡呆的生理作用[10]。

發芽黃豆因富含豐富的γ-氨基丁酸，并且大豆在發芽過程中脂肪、總糖含量降低，滿足了人們對于低脂肪、低糖、高蛋白大豆的需求[11-13]，尤其是大豆發芽過程中一些功能性因子的生物合成和積累引起了人們關注，如大豆經適當的發芽，提高了大豆中異黃酮的含量[14]以及GABA的積累量。大豆異黃酮具有抗氧化、預防骨質疏松、預防心血管疾病以及抗癌等豐富的功能。GABA是一種非蛋白氨基酸，廣泛分布于動物和植物體內，并具有多種人體的生理調節功能，是哺乳動物的神經系統的主要抑制性遞質。此外，具有多功能的生理保健作用，對于其應用到產品的研發中是十分有價值的[15]。該文以發芽黃豆為主要原料，通過固態發酵優化產Monacolin K的工藝參數，以提高產品中Monacolin K的含量，同時提高了營養和保健功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紅色紅曲菌（Monascus rubbervan Tieghem）、高產Monacolin K菌株M1、紅曲霉（Monascus rubber）GIM3.439、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sce01：武漢輕工大學實驗室保藏菌種。

1.1.2 培養基

紅曲斜面培養基：12°Bx 麥芽汁瓊脂培養基，pH自然。

固體發酵培養基：發芽黃豆100 g，葡萄糖5 g，蛋白胨3 g，NaNO30.45 g，ZnSO40.3 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.1 g。

酵母液體培養基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL，pH自然。

發芽大豆培養基：發芽黃豆50 g，裝入250 mL的三角瓶中，115 ℃，滅菌30 min。

麥芽汁斜面培養基：將麥芽粉碎后，按1∶4的比例加蒸餾水混合，63 ℃水浴加熱4～5 h糖化水解，加碘液檢測是否水解完全，4～6層紗布過濾，取濾液測糖度，加蒸餾水調至糖度為5～6，pH自然，加2.5%瓊脂條后高壓滅菌。

1.1.3 試劑

黃曲霉毒素B1、桔霉素（色譜純）：澳大利亞Fermentek Ltd公司；甲酸（色譜級）、硼酸鈉、乙腈、乙醇、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鉀，均為分析純：天津市科密歐化學試劑有限公司；洛伐他丁（色譜純）：中國藥品生物制品檢驗所；苯酚（分析純）：天津市天力化學試劑有限公司；次氯酸鈉溶液（分析純）：天津市津北精細化工有限公司；冰醋酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；甲醇（色譜級）：江蘇永華精細化學品有限公司；磷酸（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；甲苯（色譜級）：江蘇永華精細化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

FW80高速萬能粉碎機：鄭州科豐儀器設備有限公司；40/100目分樣篩：中國安平振興篩具廠；WelchromTM 反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：大連依利特分析儀器有限公司；KQ2200DV型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；1100型高效液相色譜色譜儀：美國安捷倫公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；LHS-250SC 型智能型恒溫恒濕箱：上海浦東榮豐科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母細胞破壁液制備工藝

用接種環從斜面培養基上接種已經培養18 h的酵母菌3環至50 mL PDA培養基中，在30 ℃和120 r/min培養18 h，然后將培養的釀酒酵母液經120 r/min離心、無菌水洗滌后，置于內有石英砂已滅菌研缽中研磨15 min，然后于12 000 r/min 離心1 min，所得上清液為酵母破壁液。

1.3.2 發芽大豆固態發酵功能紅曲產Monacolin K工藝

（1）發酵的工藝流程圖

（2）發酵培養的具體步驟

將保藏的紅曲菌經平板活化后，接種于麥芽汁斜面培養基上，30 ℃培養6 d，分別用3 mL 0.2%無菌冰醋酸溶液洗脫斜面孢子，接種一定量的M1和GIM3.439的混合孢子液（1∶1，V/V）于發芽黃豆固體發酵培養基中，置于恒溫恒濕培養箱內30 ℃培養6 d（其中在發酵的不同階段分別接入釀酒酵母破壁液），再轉入其他溫度的恒溫培養箱內培養15 d。待有微量菌絲長出后每隔12 h搖瓶，累積發酵完成后烘干，用高效液相色譜法檢測Monacolin K含量。

1.3.3 發芽大豆固態發酵功能紅曲產Monacolin K試驗

（1）不同初始含水量對產Monacolin K的影響

采用固體發酵培養基，在基質發芽黃豆滅菌冷卻后稱質量，調節初始含水量分別為30%、35%、40%、45%、50%、55%，接種紅曲菌M1發酵，發酵完成后檢測Monacolin K含量。

（2）分段式溫度培養對產Monacolin K的影響

采用固體發酵培養基，在其他發酵條件不改變的情況下，改變培養溫度，先把菌株置于30 ℃恒溫恒濕培養箱中進行培養，在培養6 d后，分別轉入22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃培養箱中繼續發酵15 d，發酵完成后檢測Monacolin K含量。

（3）正交試驗優化釀酒酵母破壁液對產Monacolin K的影響

在單因素試驗基礎上，根據陳璐等[16]的研究，通過對釀酒酵母破壁液的接種量、菌齡、接種時間設計L9（34）正交試驗，確定最佳的發酵條件，因素水平見表1。

表1 添加酵母破壁液發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for adding yeast wall-breaking liquid fermentation conditions optimization

1.3.4 功能成分分析

（1）Monacolin K含量測定

取發酵過篩處理后的樣品0.5 g于離心管中，用3 mL甲醇溶液溶解，再800 W超聲30 min，于40 ℃的恒溫水浴鍋中保溫過夜。離心，取上清液進行HPLC檢測。

HPLC檢測條件：檢測波長238 nm；流量1 mL/min；進樣量20 μL；柱溫25 ℃；流動相為甲醇/0.1%磷酸水=73∶27。

Monacolin K標準曲線繪制：取一定量的Monacolin K標準品溶于甲醇溶液，加入一定量物質的量濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液，超聲30 min后40 ℃水浴過夜，加磷酸溶液中和，甲醇定容至50 mL容量瓶得質量濃度為200 μg/mL的Monacolin K標準溶液，用甲醇稀釋，配制質量濃度分別為5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的標準溶液過0.45 μm濾膜待用。

（2）γ-氨基丁酸的測定

γ-氨基丁酸的檢測采用GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》。

（3）桔霉素檢測

樣品處理：將在40 ℃干燥處理的豆豉粉研磨粉碎，過100目篩，取適量的豆豉粉溶于20 mL復合萃取劑（甲苯∶乙酸乙酯∶酸=7∶3∶1），超聲20 min，3 000 r/min離心20 min，取上清液，沉淀物重復萃取兩次，收集上清液，40 ℃真空濃縮至干，用30 mL甲醇溶解，過0.45 μm濾膜待用。

色譜條件：Welch公司反向色譜柱Welchrom-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫28 ℃；紫外檢測波長254 nm；流動相為甲醇/水=55∶45，磷酸調pH 為4.0，流速為1.0 mL/min，進樣量20 μL。

桔霉素標準曲線繪制：取桔霉素標準品1 mg，用甲醛溶液稀釋成100 μg/mL，再分別配制質量濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL的標準溶液，在波長254 nm處測定其吸光度值。

（4）黃曲霉毒素B1的測定

樣品處理：取適量過篩后的紅曲粉溶于8 mL復合萃取劑（乙腈∶水=21∶4），800 W超聲提取20 min，3 000 r/min，20 min離心，取上清液，沉淀物重復萃取2次，收集上清液，40 ℃真空濃縮至干，用1 mL的流動相溶解，過0.45 μm濾膜待用。

色譜條件：反向色譜柱Welchrom-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫28 ℃；紫外檢測波長365 nm；流動相為水∶甲醇∶乙腈=5∶4∶1，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL。

標準曲線繪制：取黃曲霉毒素B1標準品1 mg，用流動相定容至1 L，再配制質量濃度分別為0.5 μg/L、1 μg/L、2 μg/L、3 μg/L、4 μg/L、5 μg/L的標準溶液，在波長365 nm處測定吸光度值。

2 結果與分析

2.1 Monacolin K標準曲線的繪制

Monacolin K標準品經配制后得到不同質量濃度的標準品溶液。以峰面積積分值y為縱坐標，Monacolin K質量濃度x為橫坐標，得到Monacolin K標準曲線回歸方程為y=43.023x。試驗表明Monacolin K在5～50 μg/mL范圍具有良好的線性關系。

2.2 基質初始含水量的確定

初始含水量對Monaconlin K含量的影響見圖1。由圖1可知，隨著基質含水量的增加，Monaconlin K含量的變化趨勢呈現先增大后減小的趨勢。在初始含水量為40%時，紅曲發酵代謝產Monacolin K含量最高。適量的水分有利于紅曲的生長，水分過低，物料干燥，菌絲生長較慢，水分過高，發酵后期游離水過多導致物料的黏液過多，均不利于功能性代謝產物的累積。因此選擇最佳基質初始含水量為40%。

圖1 初始水含量對Monaconlin K產量的影響Fig.1 Effect of initial water content on Monaconlin K production

2.3 分段培養溫度的確定

發酵溫度對Monacolin K含量的影響見圖2。由圖2可知，隨著發酵溫度的增加，Monaconlin K含量的變化趨勢呈現先增大后減小的趨勢。試驗表明在接種紅曲菌30 ℃恒溫發酵的第6天，M1、GIM3.439菌株分別轉入26 ℃恒溫培養箱中，累積發酵后檢測Monacolin K含量達到最高值。因此選擇發酵溫度為26 ℃。

圖2 發酵溫度對Monacolin K產量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on Monaconlin K production

2.4 釀酒酵母破壁液對Monacolin K的影響正交試驗結果

對釀酒酵母破壁液的接種量、菌齡、接入時間、溫度設計L9（34）正交試驗，確定最佳的發酵條件，結果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 添加酵母菌破壁液正交試驗結果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for adding yeast wall-breaking liquid fermentation conditions optimization

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiment result

由表2可知，4種因素對Monacolin K含量的影響次序為：添加量（A）＞菌齡（B）＞接入時間（C）＞溫度（D）。分析正交試驗結果得到的最優水平A3B3C2D3，即酵母菌培養40 h按3.0%的接種量接種到已接種紅曲菌發酵3 d的基質中，在26 ℃的恒溫培養箱中培養15 d。在此最佳條件下進行驗證試驗，Monacolin K產量為2.22 mg/g。由表3可知，接種量對試驗結果的影響顯著（P＜0.05），其他因素對試驗結果的影響均不顯著。

2.5 產品的功能性及安全性評價

2.5.1γ-氨基丁酸的檢測分析

依據國家標準GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》，采用全自動氨基酸分析儀進行分析，γ-氨基丁酸的含量達到16.18 mg/g。

2.5.2 桔霉素檢測分析

以峰面積為縱坐標，桔霉素濃度為橫坐標，繪制標準曲線，試驗表明在5～50 μg/L范圍具有良好的線性關系。通過檢測發酵產品中桔霉素含量為0.10 mg/kg，按日本相關標準，在限量范圍內。

2.5.3 黃曲霉毒素B1檢測分析

以峰面積積分值為縱坐標，黃曲霉毒素B1質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。試驗表明，在0.5～5.0 μg/L范圍具有良好的線性關系。通過檢測發酵產品中黃曲霉毒素B1含量為3.4 μg/kg，在國標限量范圍內。

3 結論

以Monacolin K為指標，通過單因素和正交優化發酵工藝，得到最佳的發酵條件：采用經乳酸浸泡后，基質含水量為40%的發芽大豆，經滅菌冷卻后，接種紅曲M1和GIM3.439共同發酵，發酵3 d后，按3.0%的接種量接種已培養40 h的酵母種子液，在26 ℃的恒溫培養箱中培養15 d，發酵產品中Monacolin K含量達到2.22 mg/g。原料經紅曲霉、釀酒酵母和功能紅曲發酵后，產品的色澤、風味非常好，干燥處理后香氣濃郁。營養價值高，特別是γ-氨基丁酸的積累達到16.18 mg/g。通過檢測發酵產品中桔霉素含量為0.10mg/kg，黃曲霉毒素B1含量為3.4 μg/kg，均在相關標準限量范圍內。

[1]ENDO A.Monacolin K,A new hypocholesterolemic agent produced by aMonascusspecies[J].J Antiriot,1979,2(8):852-854.

[2]張志剛，馬歌麗.紅曲霉菌的應用現狀及發展前景[J].食品加工，2007，32（8）：6-7.

[3]付海平，林親錄，何煜波.紅曲霉中Monacolin K 的研究進展[J].中國食品添加劑，2003（6）：50-54.

[4]田隨安，張向兵.高效液相色譜法測定紅曲米中莫拉可林K 的研究[J].中國衛生檢驗雜志，2009，19（9）：1996-1997.

[5]張慶慶，危勤濤，湯 斌，等.紅曲霉發酵生產Monacolin K 的研究進展[J].生物學雜志，2008，25（1）：51-54.

[6]王慧穎，王淑華.降脂紅曲的研究與應用[J].生物技術，1992（2）：5-9.

[7]張惠芳，黃之訓.功能紅曲生理活性作用機制和治療保健功效[J].中華醫學與健康，2007，3（2）：77-79.

[8]丘振宇，王亞琴，許喜林.紅曲霉中Monacolin K 的應用研究[J].中國釀造，2007，26（5）：4-6.

[9]陳運中，張聲華，陳春燕.紅曲米提取物的抗疲勞作用動物實驗[J].營養學報，2005，27（5）：433-434.

[10]張 暉，姚惠源，姜元榮.富含γ-氨基丁酸保健食品的研究與開發[J].食品與發酵工業，2002，28（9）：69-72.

[11]LEE C K,KARUNANITHY R.Effects and germination on the chemical composition of glycine and phase bean[J].J Sci Food Agr,1990(51):437-445.

[12]BAU H M,VILLAUME C,NICOLAS J P,et al.Effect of germination on chemical composition,biochemical consititnents and antinutritional factor of soya bean(glycinemax)seed[J].J Sci Food Agr,1997,73(1):1-9.

[13]苗 穎，馬 鶯.大豆發芽過程中營養成分變化[J].糧食與油脂，2005（5）：29-30.

[14]申進海，王海峰，袁 健，等.大豆發芽期異黃酮含量變化的研究及其促進劑的影響[J].中國糧油學報，2006，21（6）：75-77.

[15]肖鳳歧.積極開發GABA 食品[J].中國釀造，2004，23（12）：22-24.

[16]陳 璐，祁勇剛，王常蘇，等.多菌種混合發酵生產Monacolin K 與GABA 的研究[J].中國釀造，2012，31（4）：55-60.