氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定肉制品中氯霉素、甲砜霉素殘留

高 潔

（國(guó)貿(mào)食品科學(xué)研究所，北京 100070）

氯霉素（choloramphenicol，CAP）是一種廣譜抗菌藥物[1-2]，曾經(jīng)廣泛應(yīng)用于人體和各種動(dòng)物疾病的治療和預(yù)防[3-4]，但是近期人們逐漸發(fā)現(xiàn)氯霉素在動(dòng)物體內(nèi)殘留量很大，人一旦長(zhǎng)期食用含有氯霉素殘留的動(dòng)物產(chǎn)品就會(huì)對(duì)人體健康造成極大的威脅，嚴(yán)重者引起再生障礙貧血和灰嬰綜合癥[5]，甚至危及生命。因此國(guó)家農(nóng)業(yè)部把其列為禁止用于食品動(dòng)物的抗生素[6]。甲砜霉素（thiamphenicol，TAP）是一種氯霉素類藥物，目前也用于人和動(dòng)物，存在濫用的風(fēng)險(xiǎn)，因此有必要對(duì)其進(jìn)行監(jiān)控。

氯霉素及其同類物質(zhì)的檢測(cè)方法有很多，如酶聯(lián)免疫法[7-8]、氣相色譜法[9]、膠體金免疫層析法[10]、液相色譜法[11-12]、電化學(xué)法[13]，但是實(shí)驗(yàn)室中較為常用的還是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[16]。本試驗(yàn)采用負(fù)化學(xué)電離源氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)肉制品中的氯霉素與甲砜霉素，與單極質(zhì)譜相比，降低了基線，增大了檢測(cè)信號(hào)的信噪比，提高了靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純）、甲苯、正己烷（農(nóng)殘級(jí)），乙酸乙酯、乙醚、氯化鈉（分析純）、氯霉素甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品、間氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品：比利時(shí)Acros公司。

衍生化試劑：N，O雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷（BSTFA+TMCS，99+1）：美國(guó)REGIS公司。

固相萃取柱：弗羅里硅土柱（6.0 mL，1 g）：北京振翔貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Varian450GC/320MS配有化學(xué)電離（chemical ionization，CI）源：美國(guó)瓦里安有限公司；HR2095組織搗碎機(jī)：荷蘭皇家飛利浦公司；固相萃取裝置：北京振翔科技有限公司；R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士步琪有限公司；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山舒美超聲儀器有限公司；LC-212恒溫箱：廣東宏展科技有限公司；DSY-Ⅲ氮吹儀：蘇州奇樂電子科技有限公司；CS-H1渦旋混合器：南京東邁科技儀器有限公司；TDL-5-A離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法[21]

1.3.1 樣品處理方法

稱取5 g粉碎的肉制品于50 mL具塞離心管中，加入0.5 μg/mL內(nèi)標(biāo)10 μL和30 mL乙酸乙酯離心取上清液，再提取一次合并提取液，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1～2 mL，待凈化。正己烷液-液萃取，棄去正己烷層，水相用40 mL乙酸乙酯分兩次提取，合并乙酸乙酯相于心形瓶中，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，氮?dú)獯蹈伞８チ_里硅土柱依次用5 mL甲醇、5 mL甲醇-乙醚（3+7）和5 mL乙醚淋洗備用。將前述殘?jiān)? mL乙醚溶解上樣，用5 mL乙醚淋洗，5 mL甲醇-乙醚（3+7）洗脫，洗脫液用氮?dú)獯蹈伞艋蟮脑嚇佑?.2 mL甲苯溶解，加入0.1 mL衍生化試劑混合，于70 ℃衍生60 min。氮?dú)獯蹈桑?.0 mL正己烷定容，待測(cè)定。

1.3.2 色譜條件[17]

VF-5MS色譜柱：30 m×0.25 mm×0.25 μm；50 ℃保持1 min，以25 ℃/min程序升溫至280 ℃，保持5 min；自動(dòng)進(jìn)樣器，無分流進(jìn)樣1 μL，載氣：氦氣；離子源：200 ℃，負(fù)離子化學(xué)源（negative chemical ionization，NCI）模式，反應(yīng)氣為甲烷，壓力800 Pa，電子能量70 eV，掃描方式為多離子監(jiān)測(cè)模式。氯霉素選擇母離子為m/e466，監(jiān)控子離子為m/e304和m/e322；甲砜霉素選擇母離子為m/e499，監(jiān)控子離子為m/e355與265。碰撞誘導(dǎo)解離（collision induced dissociation，CID）氣壓：氬氣0.239 Pa。

1.4 計(jì)算公式

樣品中氯霉素與甲砜霉素的含量（X）按下式計(jì)算：

注：X為樣品中氯霉素與甲砜霉素含量，μg/kg；C為試樣中氯霉素與甲砜霉質(zhì)量濃度，μg/L；V為試樣最終定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 二級(jí)質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.1.1 母離子選擇

在一級(jí)質(zhì)譜條件下氯霉素的主要離子有m/e466、468、376、378，甲砜霉素的主要離子有m/e409、411、499、501。其中氯霉素的m/e466離子響應(yīng)最大，甲砜霉素m/e499離子響應(yīng)最大，因此選擇這兩個(gè)離子分別作為兩種物質(zhì)的母離子。

2.1.2 子離子選擇

分別以m/e466和m/e499離子為母離子，固定CID氣壓0.239 Pa，在不同電壓條件下掃描質(zhì)荷比100～500范圍內(nèi)兩種母離子的子離子碎片，結(jié)果分別如圖1與圖2所示。

從圖1、圖2可以看出，氯霉素響應(yīng)最大的兩個(gè)子離子為m/e322與m/e304，甲砜霉素響應(yīng)最大的兩個(gè)離子為m/e355與m/e265。

圖1 氯霉素子離子選擇Fig.1 Selection of ions for chloramphenicol

圖2 甲砜霉素子離子選擇Fig.2 Selection of ions for thiamphenicol

2.1.3 碰撞電壓優(yōu)化

固定氯霉素與甲砜霉素的母離子與子離子，改變碰撞電壓，記錄離子響應(yīng)強(qiáng)度，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，466-304離子對(duì)最佳碰撞電壓為6 V，466-322離子對(duì)最佳碰撞電壓為5 V，499-355離子對(duì)最佳碰撞電壓為6 V，499-265離子對(duì)最佳碰撞電壓為7 V。

2.2 靈敏度比較

取不含目標(biāo)化合物的陰性樣品加標(biāo)氯霉素與甲砜霉素各10 ng后進(jìn)行檢測(cè)，一級(jí)質(zhì)譜與二級(jí)質(zhì)譜定量離子的信噪比如表1所示，譜圖比較如圖4所示。由表1、圖4可以看出，采用二級(jí)質(zhì)譜后信噪比明顯提高從而提高了檢測(cè)靈敏度。

圖4 一級(jí)質(zhì)譜與二級(jí)質(zhì)譜靈敏度比較Fig.4 Sensitivity of MS and MS/MS

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

將處理好的梯度濃度標(biāo)液依次進(jìn)樣，以標(biāo)樣峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比對(duì)標(biāo)樣與內(nèi)標(biāo)濃度之比作圖，得到工作曲線，氯霉素：y=0.975 9x-0.063 3，r2=0.992 5；甲砜霉素：y=3.581 5x+0.072 9，r2=0.997 3，檢出限為：氯霉素0.02 μg/kg，甲砜霉素0.1 μg/kg。

2.4 加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

表2 加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of adding standard recovery and degree of precision

取不含目標(biāo)化合物的陰性樣品進(jìn)行不同加標(biāo)水平加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平平行進(jìn)行8次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。由表2可知，氯霉素及甲砜霉素的加標(biāo)回收率在86%～97%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為3.8%～12.3%。

3 結(jié)論

采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，采用負(fù)化學(xué)電離源，對(duì)氯霉素與甲砜霉素分別選擇合適的母離子、子離子及碰撞電壓，有效減少了基質(zhì)干擾，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性與靈敏度。實(shí)際樣品不同濃度水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方法具有良好的線性、準(zhǔn)確度與精密度，可實(shí)現(xiàn)對(duì)肉制品中痕量氯霉素與甲砜霉素的準(zhǔn)確快速檢測(cè)。

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