p27kip1蛋白在結腸癌組織中的表達及意義

程翅 張海峰 閆康鵬 梁磊

p27kip1蛋白在結腸癌組織中的表達及意義

程翅 張海峰 閆康鵬 梁磊

目的 探討p27kip1蛋白在結腸癌組織中的表達及意義。方法應用免疫組化方法檢測結腸癌組織（觀察組40例）及癌旁正常組織（對照組20例）中p27kip1蛋白的表達，比較其陽性表達率，并比較分析觀察組不同分化程度及有無淋巴結轉移患者p27kip1蛋白的陽性表達程度。結果觀察組中p27kip1蛋白陽性表達16例（40．00%），對照組中p27kip1蛋白陽性表達15例（75．00%），差異有統計學意義（P＜0．05）。高、中分化患者p27kip1蛋白的陽性表達程度明顯高于低分化患者，差異有統計學意義（P＜0．05）。有淋巴結轉移患者p27kip1蛋白的陽性表達程度明顯低于無淋巴結轉移患者，差異有統計學意義（P＜0．05）。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者p27kip1蛋白陽性表達12例（63．16%），Ⅲ～Ⅳ期患者p27kip1蛋白陽性表達4例（19．05%），差異有統計學意義（P＜0．05）。結論p27kip1蛋白作為抑癌因子具有調控細胞增殖、分化及凋亡的能力，而組織中p27kip1蛋白的低表達可能導致了腫瘤的發生、發展。p27kip1蛋白可能作為臨床上檢測結腸癌的新指標，有助于結腸癌的腫瘤分化、腫瘤轉移及腫瘤TNM分期的診斷。

p27kip1 結腸癌 結腸腫瘤

目前，結腸癌發病原因尚不清楚，可能與飲食、遺傳因素、致癌物質、慢性炎癥、癌前病變等因素有關。1994年，Polyak等[1]發現的p27kip1基因位于人12號染色體的12p12～12p13.1交界處，包含2個有編碼功能的外顯子、1個無功能的外顯子和1個內含子，其產物為相對分子質量為27 000的熱穩定蛋白，含有198個氨基酸，能與細胞周期依賴激酶和周期素（cyclin）如cyclinF-cdk2、cyclinD-cdk4及cyclinD-cdk6等結合，并發揮其激酶抑制作用。新近研究發現，多種人類腫瘤中存在p27kip1蛋白表達減少或缺失，而p27kip1蛋白水平與惡性腫瘤的生物學行為存在一定的負相關。目前，臨床上普遍認為p27kip1基因是一種新的抑癌基因。Harvat等[2]發現，外源性加入純化的p27kip1蛋白或使內源性p27kip1蛋白釋放增加均可導致細胞生長停滯。因此，了解p27kip1蛋白的調節機制對腫瘤的基因治療及相關腫瘤藥物治療靶點的選擇有著重要的臨床意義。p27kip1蛋白在胃癌[3]、肝癌[4]等腫瘤中呈低表達現象，其在結腸癌中是否也呈低表達現象呢？本研究旨在探討結腸癌中p27kip1蛋白的表達情況及意義，以期為結腸癌的治療提供實驗依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2012-01—2013-07月本院收治的40例結腸癌患者，組織標本均為手術切除標本，病理診斷結腸癌。術前均未行化療、放療及其他腫瘤相關治療。將40例患者的結腸癌組織標本作為觀察組，其中男26例，女14例；年齡40～79（66±2）歲；TNM分期（1997年UICC分類分期法）：Ⅰ期11例，Ⅱ期8例，Ⅲ期11例，Ⅳ期10例；高分化癌11例，中分化癌12例，低分化癌17例；淋巴結轉移陽性21例，陰性19例。并隨機選取20例觀察組組織標本的癌旁切緣2cm以上正常結腸組織標本作為對照組，其中男12例，女8例，年齡40～79（64±2）歲。病理檢查確定為正常結腸組織。所有組織標本均經10%中性甲醛溶液固定，常規脫水后石蠟包埋，4μm連續切片，分別用于免疫組化染色。

1.2 主要試劑 鼠抗人p27kip1單克隆抗體（北京中衫金橋生物有限公司國際代理；SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC），二步法免疫組化檢測試劑PV-9000（北京中衫金橋生物有限公司）；DAB顯色試劑盒（北京中衫金橋生物有限公司）。

1.3 免疫組化方法 嚴格按照標準免疫組化染色操作步驟進行。免疫組化染色對照：p27kip1蛋白用已知結腸癌的陽性片作為陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。1.4 結果判定 所有切片采用雙盲法由2位病理科專家獨立閱片。p27kip1蛋白陽性主要為細胞質出現棕黃色，細胞核也可見表達。隨機觀察10個高倍視野（×400）并計數，每個視野至少計數100個細胞，取其平均值計算細胞陽性率，并據此對染色結果分級。參照文獻[5]：p27kip1蛋白陽性率＜10%為陰性（-），10%～50%為弱陽性（+），≥50%為強陽性（++）。

1.5 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件，率的比較采用χ2檢驗，等級資料的比較采用Ridit分析。

2 結果

2.1 p27kip1蛋白陽性表達情況 見圖1-2。

圖1 正常結腸組織中p27kip1蛋白表達強陽性（a：SP× 200；b：SP×400）

圖2 結腸癌組織中p27kip1蛋白表達陽性（a：SP×200；b：SP×400）

2.2 兩組標本組織中p27kip1蛋白陽性表達率的比較 觀察組中陽性表達16例（40.00%），陰性表達24例（60.00%）；對照組中陽性表達15例（75.00%），陰性表達5例（25.00%）。觀察組中p27kip1蛋白陽性表達率明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 觀察組不同分化程度患者p27kip1蛋白表達的比較 見表1。

表1 觀察組不同分化程度患者p27kip1蛋白表達的比較（例）

由表1可見，高、中分化患者p27kip1蛋白的陽性表達程度明顯高于低分化患者，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。

2.4 觀察組淋巴結轉移與未轉移患者p27kip1蛋白表達的比較 見表2。

表2 觀察組淋巴結轉移與無轉移患者p27kip1蛋白表達的比較（例）

由表2可見，有淋巴結轉移患者p27kip1蛋白的陽性表達程度明顯低于無淋巴結轉移患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.5 觀察組不同TNM分期患者p27kip1蛋白陽性表達率的比較 見表3。

由表3可見，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者p27kip1蛋白陽性表達率明顯高于Ⅲ～Ⅳ期，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 觀察組不同TNM分期患者p27kip1蛋白陽性表達率的比較[例（%）]

3 討論

目前，國內外尚無文獻報道p27kip1蛋白在結腸癌細胞中的表達定位。Fan等[6]應用免疫組化法檢測109例喉鱗狀細胞癌組織中p27kip1蛋白的表達水平時發現，p27kip1蛋白主要定位于細胞核，偶見胞質或胞質與胞核同時表達。本研究結果顯示，p27kip1蛋白陽性表達主要定位于胞質，胞核僅少部分表達，偶見胞質與胞核同時表達，與Fan等的研究結果不符，提示p27kip1蛋白在不同細胞中的表達位置有所不同，其具體原因有待進一步研究。

p27kip1蛋白亦參與細胞的誘導分化和凋亡，p27kip1蛋白水平的降低使得細胞凋亡減少也可能是促進腫瘤的發生、發展的機制。Florenes等[7]及Kuo等[8]在皮膚癌和口腔癌中同樣發現p27kip1蛋白的低表達水平。Sui等[9]采用免疫組化法觀察22例卵巢上皮性良性腫瘤、23例卵巢上皮性交界性腫瘤、34例卵巢上皮性惡性腫瘤中的p27kip1蛋白表達與組織學分級發現，p27kip1蛋白與腫瘤惡性程度呈負相關，提示低p27kip1蛋白促進卵巢上皮性腫瘤的發展。本研究結果發現，p27kip1蛋白在結腸癌組織的陽性表達率顯著低于在癌旁正常結腸中的陽性表達率，提示p27kip1蛋白表達的降低可能促進結腸癌的發生、發展；p27kip1在高分化型結腸癌組織表達量最強，在低分化型結腸癌組織中表達量最弱，提示p27kip1蛋白水平的高低可能與結腸癌的細胞分化程度有關。

新近研究表明，p27kip1蛋白可增強細胞間的黏附作用，促進鈣粘素的叢集，而鈣粘素具有介導細胞間和細胞與基質間的黏附作用；同時，p27kip1蛋白可阻止正常細胞與基質結合[10]。而調節p27kip1蛋白表達的信號可能通過改變細胞形狀或改變細胞接受胞外信號的能力而達到調節細胞間的黏附作用。本研究結果顯示，觀察組中有淋巴結轉移患者p27kip1蛋白的表達量低于無淋巴結轉移組患者，表明p27kip1蛋白可能與結腸癌的侵襲轉移有關。p27kip1蛋白的表達水平在結腸癌不同臨床分期上的研究國內外尚無相關報道。而在臨床上，結腸癌早期和晚期的治療方法和治療效果都相差較大，因此臨床上對結腸癌早期和晚期的診斷尤為重要。本研究發現，p27kip1蛋白在TNM分期Ⅰ～Ⅱ期（早期）中的表達量高于Ⅲ～Ⅳ期（晚期）中的表達量，表明p27kip1蛋白的表達水平可能與腫瘤的分期有關，腫瘤早期p27kip1蛋白尚有明顯表達，而腫瘤晚期p27kip1蛋白則表達不明顯。因此，p27kip1蛋白有可能作為一種臨床診斷結腸癌早期和晚期的新指標，有待進一步研究。本實驗采用免疫組化法通過對40例結腸癌組織和20例癌旁正常結腸組織的檢測，實驗結果與假設相一致，證實了p27kip1蛋白在結腸癌中的低表達，可能與結腸癌的細胞分化程度、轉移和腫瘤臨床分期有關。

綜上所述，p27kip1蛋白在結腸癌中的低表達，可能與結腸癌的細胞分化程度、轉移和腫瘤臨床分期有關。深入探討p27kip1蛋白在結腸癌發生、發展中的作用，將有助于進一步了解結腸癌的發生機制，從而為結腸癌的治療提供一定的實驗依據，p27kip1蛋白也將成為結腸癌試驗性基因治療的靶點。

[1]Polyak,Kato J Y,Solomon M T,et al．P27kip1,a cyclin-CDK inhibitor,links transforming growth factorbeta and contact inhibition to cell cyclin arrest[J]．Genes Dev,1994,8(1)：9．

[2]Harvat B L,Seth P,Jetten A M．The role of p27kip1 in gamma interferon-mediated growth arrest of mammary epithelial cells and related defects in mammary carcinnoma cells[J]．Oncogene, 1997,14(17)：2111．

[3]Mori M,Mimori K,Shiraishi T,et al．P27 expression and gastric carcinoma[J]．Nat Med,1997,3(6)：593．

[4]Ito Y,Matsuura N,Sakom M,et al．Clinical outcomes after hepatitis C infection from contaminated anti-D immuneglobulin[J]．Heptology,1999,30(1)：90．

[5]Tamura N,Dong Y,Sui L,et al．Cyclin-dependent kinase inhibitor p27 is related to cell proliferation and prognosis in laryngeal squamous cell carcinomas[J]．J Laryngol Otol,2001,115(5)：400-406．

[6]Fan G K,Fujieda S,Sunaga H,et al．Expression of protein p27 is associated with progression and prognosis in laryngeal cancer [J]．Laryngoscope,1999,109(5)：815．

[7]Florenes V A,Maelandsmo G M,Kerbel R S,et al．Protein Expression of the cell-cycle inhibitor p27kip1 in Melanoma：inverse correlation with disease-free survival[J]．Am J Pathol,1998,153 (1)：305-312．

[8]Kuo M Y,Hsu H Y,Kok S H,et al．Prognostic role of p27 kip expression in oral squamous cell carcinoma in Taiwan[J]．Oroal On-col,2002,38(2)：172．

[9]Sui L,Dong Y,Ohno M,et al．JAB1 expression is associated with inverse expression of p27kip1 and poor prognosis in epithelial ovarian tumors[J]．Clin Cancer Res,2001,7(12)：4130-4135．

[10]Supriatno,Harada K,Kawaguchi S,et al．Effect of p27kip1 on the ability of invasion and metastasis of an oral cancer cell line [J]．Oncol Rep,2003,10(3)：527-532．

Empirical study of expression of p27kip1 proteins in carcinoma of colon

Objective To study the express of p27kip1 in carcinoma of colon，then to investigate its roles and probable mechanism in the pathogenesis of colon cancer．MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression and distribution of p27kip1 in carcinoma of colon and normal colon．Statistics was used to analyze the data．Making a analysis of positive expression level of p27kip1 protein in colon caner tissue with different degree of differentiation and lymph node metastasis．Results16 cases of positive expression of p27kip1 Protein in observation group(40%),15 cases of positive expression of p27kip1 Protein in the control group(75%),the difference was statistically significant(P＜0．05)．The expression of p27kip1 Protein in group of high degree of differentiation was significantly higher than that group of low differentiated．The difference was statistically significant(P＜0．05)．The positive expression of p27kip1 Protein in patients with the extent of lymph node metastasis was significantly lower than that in patients without lymph node metastasis,the difference was statistically significant(P＜0．05)．12 cases of positive expression of p27kip1 Protein in TNM stage I～II(63．16%),4 cases of positive expression of p27kip1 Protein in TNM stageⅢ～Ⅳ(19．05%),the difference was statistically significant(P＜0．05)．Conclusionp27kip1 protein as a tumor suppressor factor that can regulate cell proliferation,differentiation and apoptosis of ability．Low expression of p27kip1 protein led to tumor occurrence and development in organization．Protein of p27kip1 would be considered as new clinical index of colon carcinoma,and make for diagnose of neoplasm differentiation,neoplasm metastasis and TNM staging．

p27kip1 Colon cancerImmunohistochemical

2013-07-26）

（本文編輯：歐陽卿）

325200 溫州醫科大學附屬第三醫院普外二科

張海峰，E-mail：15825618600@163.com