Stathmin基因在Ⅱ期非小細胞肺癌中表達的意義

王小紅 周星明 江洪 張谷 蘇丹

●論 著

Stathmin基因在Ⅱ期非小細胞肺癌中表達的意義

王小紅 周星明 江洪 張谷 蘇丹

目的 探討Ⅱ期非小細胞肺癌（NSCLC）中Stathmin mRNA和蛋白表達水平與患者預后的關系。方法單基因定量法檢測已手術Ⅱ期NSCLC患者腫瘤組織中Stathmin mRNA表達；免疫組化法檢測患者腫瘤組織中Stathmin蛋白表達水平。所有患者行長春瑞濱聯合順鉑方案化療，統計學分析其表達水平與患者臨床病理學特征之間的關系，并隨訪患者的無瘤生存時間（DFS）和總體生存時間（OS），統計學分析StathminmRNA和蛋白表達水平與患者的DFS、OS的關系。結果Stathmin mRNA表達水平與患者的T、N分期顯著相關，與患者的年齡，病理類型均無顯著相關性；Stathmin蛋白表達水平與患者的年齡、病理類型、T、N分期均無顯著相關性；Stathmin mRNA和蛋白表達水平與患者的OS，DFS均無顯著相關性。結論Ⅱ期NSCLC患者腫瘤組織中Stathmin表達水平不能作為預測患者預后的指標。

肺腫瘤 Stathmin

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤，在惡性腫瘤相關死亡原因中占第一位。非小細胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌病例的80%，5年生存率不足15%。近年研究表明，細胞信號轉導中相關因子的表達異常、腫瘤細胞DNA修復的異常與肺癌的發生、發展存在密切聯系。因此，我們用單基因定量法檢測了73例已手術Ⅱ期NSCLC患者腫瘤組織中Stathmin mRNA表達，免疫組化法檢測患者腫瘤組織中Stathmin蛋白表達，評價其表達水平與患者臨床病理學特征之間的關系，同時隨訪患者的無瘤生存時間（DFS）和總體生存時間（OS），統計分析Stathmin mRNA和蛋白表達水平與患者DFS、OS的關系。我們試圖探索Stathmin在肺癌發生、發展過程中起到的作用，并研究Stathmin基因表達水平與患者預后的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 所有標本均從本院標本庫中篩選（患者均簽定知情同意書，醫院倫理委員會討論通過）。術后病理按照2006年國際抗癌聯盟（UICC）TNM分期標準進行分期，共篩選2007-09—2010-06經根治性手術切除的Ⅱ期NSCLC患者73例。其中男58例，女15例；年齡≤60歲55例，＞60歲18例；腫瘤大小≤3cm 22例，＞3cm 51例；無淋巴結轉移28例、有淋巴結轉移45例；高-中分化53例、低分化20例；腺癌33例、鱗癌36例、其他病理類型4例。

1.2 輔助化療 患者術后轉至化療科行長春瑞濱聯合順鉑化療，順鉑75mg/m2分3d給予，長春瑞濱25mg/m2第1、8天，以上方案每3周重復。其中1例患者因骨轉移只進行2周期化療，有4例患者第1周期化療在本院進行，余3個周期化療在當地進行，其余患者均在本院完成4個周期的化療。

1.3 隨訪資料（DFS和3年生存率） 73例患者，70例通過電話隨訪，其中失訪3例，由指定醫師完成，每3個月1次。隨訪率為95.89%，失訪病例按截尾值處理。

1.4 mRNA檢測 用單基因定量（Quanti-Gene Assay）方法進行，由基因科技（上海）有限公司完成。步驟如下：先將3～5片的石蠟切片樣本直接用200μl裂解液裂解完全消化后，室溫12 000r/min，離心半徑9cm，離心取上清液，與反應系統的各試劑包括微珠和探針等混合，在54℃600r/min的條件下過夜混合雜交，雜交后利用磁力洗去未雜交到微珠上的雜質。接著對捕捉到的RNA信號利用bDNA技術做級聯放大，通過預放大，放大，標記探針在50℃600r/min的條件下分別作1h雜交，每一步雜交后都需要用洗滌液洗3次。最后做SAPE標記后利用Luminex 200讀取基因表達數據。檢測過程按文獻[1]的方法進行。檢測Stathmin mRNA的寡核苷酸探針QuantiGene 2.0工具由Panomics公司設計并合成。HPRT1基因作為質量控制基因,每個樣本均檢測待檢基因和HPRT1基因拷貝數。

1.5 Stathmin蛋白水平檢測 采用免疫組化方法，由本院病理科完成，免疫組化試劑購自福州邁新公司。Stathmin蛋白主要表達在細胞質中，陽性呈棕黃色，以內皮細胞作陽性對照。結果判斷采用半定量法，即結合陽性細胞的染色強度和百分比來判定表達狀態。染色強度：無色0分、淺黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分。著色細胞比例：無著色0分、＜5%為1分、6%～30%為2分、31%～60%為3分、≥61%為4分。兩者相加得分為判定級別：≤2分為陰性，＞2分為陽性。

1.6 統計學處理 應用SPSS17.0軟件完成，采用COX模型進行單因素分析，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并經Log-rank檢驗。

2 結果

2.1 癌組織中Stathmin mRNA的表達 均值0.916739，中位值0.6318，極小值0.335，極大值5.0746，方差0.975。

2.2 癌組織中Stathmin蛋白表達 在73例患者中，Sthatmin陰性45例，陽性28例，陽性率為38.4%，見圖1、2。

圖1 Sthatmin高表達

圖2 Sthatmin低表達

2.3 Stathmin表達水平與患者臨床病理學特征之間的關系 Stathmin mRNA表達水平與患者的T、N分期顯著相關，與患者的年齡、病理類型均無顯著相關性；Stathmin蛋白表達水平與患者的年齡、病理類型、T、N分期均無顯著相關性，見表1。2.4 隨訪結果 70例患者中19例在隨訪期間死亡，3年生存率為為75.1%，5年生存率為56.6%，中位生存時間68個月（95%CI：45.21～90.79），見圖3。

表1 Stathmin表達水平與患者臨床病理學特征之間的關系（例）

圖3 70例患者的生存曲線圖

2.5 不同Stathmin表達患者OS、DFS的比較 Stathmin mRNA低表達患者OS、DFS與高表達患者相比，均無統計學差異，見圖4、5。

圖4 不同Stathmin表達患者的DFS曲線圖（χ2=0.227，P=0.633）

圖5 不同Stathmin表達患者的OS曲線圖（χ2=1.907，P=0.167）

2.6 Sthatmin蛋白表達水平與患者預后的關系 Sthatmin陰性者44例，陽性者26例，兩組患者的OS、DFS比較，差異意義均無統計學，見圖6、7。

圖6 不同Stathmin蛋白表達水平患者的DFS曲線圖（χ2=0.229，P=0.633）

圖7 不同Stathmin蛋白表達水平患者的OS曲線圖（χ2=2.365，P=0.124）

3 討論

Stathmin是一種重要的微管解聚蛋白，作為細胞信號轉導分子在細胞分化、組織再生與修復、尤其在惡性腫瘤的發生、發展及表型決定上有重要作用及意義。在細胞周期的不同階段通過磷酸化和去磷酸化作用，對細胞微管系統動力平衡的調節發揮十分重要的作用。雖然沒有直接的證據表明Stathmin高表達與惡性腫瘤的轉化直接相關,但有證據提示腫瘤細胞高增殖率與它直接相關。Singer等[2]發現，在NSCLC中，無論腺癌還是鱗癌細胞中均可觀察到Stathmin及其家族成員Stathminlike 3（SCLIP）高表達而引起的腫瘤細胞分裂增殖加快和基質浸潤、細胞遷移運動增加的現象。也有學者證明Stathmin基因表達水平與肺癌的分化程度成反比，即Stathmin基因表達水平越高，肺癌分化程度越低。同時，他們還認為Stathmin基因高表達可以作為診斷肺癌的腫瘤標志物。我們的研究也提示Stathmin mRNA表達水平與肺癌的腫瘤大小，淋巴結轉移等多種臨床病理學特征有關，但以上的研究證據均是在中晚期肺癌中獲得的。Stathmin基因在肺癌尤其是早期肺癌發生、發展過程中的作用，尚待進一步研究證實。

目前的研究表明Stathmin在多種惡性腫瘤中表達升高，且其表達水平與腫瘤惡性度和預后密切相關，可能成為新的治療靶點。在口腔鱗狀細胞癌中和消化系統腫瘤中，顯著升高的Stathmin水平與腫瘤的TNM分期、分化程度及預后密切相關[3-4]。在乳腺癌、子宮內膜癌和卵巢癌中的研究表明，Stathmin表達有獨立的預后價值，且Stathmin高表達的卵巢癌患者使用紫杉醇和鉑類化療預后不良。這一發現支持Stathmin可能會干擾紫杉醇治療，導致預后不良[5-6]。

肺癌中目前未有明確證據證實Stathmin表達與患者預后有關。蒲驍麟等[7]報道，在晚期NSCLC中，免疫組織化學方法測得的Stathmin表達水平與長春瑞濱+順鉑/卡鉑（NP）方案的化療療效負相關，且可能與患者的預后負相關。但我們的研究結果表明：Ⅱ期NSCLC術后標本中Stathmin mRNA和蛋白表達均與患者預后無關，不能作為患者預后的獨立預測指標。其高表達患者與低表達患者相比，DFS和OS均無統計學差異。

為什么會出現上述不一致的結果呢？這種不同結果的解釋可能是：（1）是否Stathmin的表達在不同期別的NSCLC存在著不同的預測結果?我們的研究結果也提示患者的T、N分期級別越高，Stathmin mRNA的表達水平越高。（2）檢測的病例、樣本和標準的不同。目前的研究多為晚期病例，且多采用穿刺或纖支鏡標本，組織樣本量較少，而我們的檢測對象為Ⅱ期NSCLC的術后標本，樣本含量大。（3）樣本例數的限制。（4）隨訪時間的長短可能都是造成結果不同的原因。這也反映了Stathmin的表達對肺癌患者預后的預測價值不如對乳腺癌、卵巢癌和消化系統惡性腫瘤，仍需大樣本前瞻性試驗的證實[8]。因此，我們正在不斷積累樣本例數，并且嘗試使用更多的方法來檢測更多不同期別的肺癌標本中微管基因的表達水平，以期獲得更加準確的結果。

[1]Eastham L L,Mills C N,Niles R M.PPARalpha/gamma expression and activity in mouseand human melanocytes and melanoma cells[J].Pharm Res,2008,25(6)：1327-1333.

[2]Singer S,Malz M,Herpel E,et al.Coordinated expression of Stathmin family members by far upstream sequence element-binding protein-1 increases motility in non-small cell lung cancer[J]. Cancer Res,2009,69(6)：2234-2243.

[3]Jeon T Y,Han M E,Lee Y W,et al.Overexpression of Stathmin1 in the diffuse type of gastric cancer and its roles in proliferation and migration of gastric cancer cells［J].Br J Cancer,2010,102：710-718.

[4]Gan L,Guo K,Li Y,et al.Up-regulated expression of Stathmin may be associated with hepatocarcinogenesis[J].Oncol Rep, 2010,23：1037-1043．

[5]Su D,Smith S M,Preti M,et al.Stathmin and tubulin expression and survival of ovarian cancer patients receiving platinum Treatment with and without paclitaxel[J].Cancer,2009,115(11)：2453-2463．

[6]McGrogan B T,Gilmartin B,Carney D N,et al.Taxanes,microtubules and chemoresistant breast cancer[J].Biochim Biophys Acta,2008,1785(2)：96-1321.

[7]蒲驍麟,王峻,許林,等.β-tubulin-Ⅲ和Stathmin與晚期NSCLC化療敏感性的關系[J].中國肺癌雜志,2009,12(1)：49-53.

[8]Stengel C,Newman S P,Leese M P,et al.Class III beta-tubulin expression and in vitroresistance to microtubule targeting agents[J]. Br JCancer,2010,102(2)：316-324．

（本文編輯：田云鵬）

《浙江醫學》對圖表的要求

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本刊編輯部

Expression of Stathmin in stage II non-small cell lung cancer and its significance

Objective To investigate the expression of Stathmin in stageⅡnon-small cell lung cancer(NSCLC)and its significance.MethodsThe expression of Stathmin mRNA and protein was detected by Quanti-Gene Assay and immunohistochemistry,respectively.All patients received NP chemotherapy.The patients were followed-up;the disease-free survival(DFS) and overall survival(OS)were observed.The correlation of Stathmin expression level with the clinicopathological features of NSCLC and prognosis of patients were analyzed.ResultsStathmin mRNA expression levels was significantly correlated with T stage and N stage.There was no significant correlation of Stathmin mRNA and protein expression levels with the OS and DFS of patients.ConclusionIn patients with stageⅡ NSCLC,the expression levels of Stathmin mRNA and protein in cancer tissue cannot be used as a prognostic indicator.

Lung cancer Stathmin

2013-12-11）

浙江省教育廳資助課題（2007-01345）

310022 杭州，浙江省胸部腫瘤（肺、食管）診治技術研究重點實驗室、浙江省腫瘤醫院化療科（王小紅），胸外科（周星明、江洪），病理科（張谷），研究所（蘇丹）

江洪，E-mail：hh110120@126.com