microRNA-195在食管鱗狀上皮細胞癌中的表達及臨床意義

王江峰 凌志強 毛偉敏

microRNA-195在食管鱗狀上皮細胞癌中的表達及臨床意義

王江峰 凌志強 毛偉敏

目的 檢測microRNA-195（miR-195）在食管鱗狀上皮細胞癌組織中的表達水平，探討其臨床病理生理學意義。方法應用實時熒光聚合酶鏈反應法檢測94例食管鱗狀上皮細胞癌組織和配對癌旁正常組織中miR-195的表達水平，并分析miR-195表達水平與食管鱗狀上皮細胞癌患者臨床病理學特征及預后之間的關系。結果食管鱗狀上皮細胞癌組織中miR-195不同程度低表達45例（47.9%），正常表達39例（41.5%），高表達10例（10.6%）。miR-195低表達者比例在有無淋巴結轉移、不同TNM分期者中的差異有統計學意義（P＜0.05）；miR-195表達水平與患者無瘤生存期顯著相關，是食管鱗狀上皮細胞癌患者預后的獨立危險因素。結論miR-195下調影響食管鱗狀上皮細胞癌進展和患者預后，可能起著抑癌基因功能。

microRNA-195 食管鱗狀上皮細胞癌 無瘤生存期 抑癌基因

近年來世界范圍內食管癌的發病率和病死率已居惡性腫瘤第6位[1]。食管癌的病理類型主要為鱗狀細胞癌和腺癌，鱗狀細胞癌主要位于食管中上段，占食管癌的90%；其余少部分為腺癌，一般位于食管下段[2]。食管鱗狀上皮細胞癌（簡稱食管鱗癌）確診時往往已為晚期，盡管治療方案的選擇迅速發展，但侵襲和轉移患者的預后不佳。微小RNA（microRNAs）是一類長19～22nt的單鏈非編碼小分子RNA，通過與靶基因mRNA的3′非編碼區不完全互補結合，在轉錄后水平上影響靶基因mRNAs降解或翻譯[3-4]。一個miRNA可通過調控多個靶基因mRNAs發揮著癌基因或抑癌基因的功能[5-6]。有研究表明，microRNA-195（miR-195）在肝癌和結腸、直腸癌組織中的表達水平明顯降低，且與腫瘤的增殖、周期、淋巴轉移和預后等相關[7-8]。也有研究表明，miR-195在食管鱗癌中的表達與細胞增殖、浸潤和轉移相關[9]。本研究采用實時熒光定量聚合酶鏈反應法（realtime PCR）檢測食管鱗癌組織中miR-195的表達水平，分析其與患者臨床病理特征和預后之間的關系，旨在探討miR-195的表達在食管癌進展、預后中的意義,為預測食管癌轉移潛能和評估預后尋找新的生物學指標，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2008-02—2009-11浙江省腫瘤醫院食管癌手術切除組織標本94例，均為食管鱗癌及其配對癌旁正常組織，患者男82例，女12例，年齡46～80歲，平均（63.26±7.88）歲。術前未經任何放化療及其它治療，排除自身免疫性疾病或嚴重感染性疾病；癌旁正常組織取自腫瘤邊緣5cm外區域肉眼下正常食管組織，食管癌根治術中標本切取后均立即放入液氮，并立即轉移至-80℃冰箱保存。食管癌TNM分期、腫瘤分級均參照國際抗癌聯盟（UICC）的標準。記錄患者是否吸煙（指一生中連續或累計吸煙6個月以上，并且平均每天至少吸1支）和飲酒（指平均每周1次以上飲用任何酒）[10]。本研究經醫院倫理委員會同意，患者均進行電話隨訪，隨訪截止時間為2012-07-04。

1.2 試劑 RNA提取試劑盒MirNeasy Mini Kit購自德國Qiagen公司，反轉錄試劑盒PrimeScriptRmiRNA cDNA Synthesis Kit（D350A）和real-time PCR試劑盒SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（DRR081A）購于日本TaKaRa公司。引物由上海捷瑞公司合成。Real time RT-PCR上游引物序列：miR-195：5′-TAGCAGCACAGAAATATTGGC-3′，內參基因U6：5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游通用引物由反轉錄試劑盒PrimeScriptRmiRNA cDNA Synthesis Kit（D350A）提供。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取 按照MirNeasy Mini Kit試劑盒說明書提取腫瘤組織及對應正常組織的總RNA，紫外分光光度計測量，檢測提取總RNA的濃度和純度，測定吸光度值（A），要求A260/A280=1.8～2.1。凝膠電泳測定RNA的完整性。

1.3.2 逆轉錄 采用梯度PCR儀（Bio-Rad S1000），按PrimeScrip miRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書將上述提取總RNA（1μg）進行cDNA的合成。逆轉錄體系（20μl）：2×miRNA Reaction Buffer Mix 10μl，0.1%BSA 2μl，miRNA PrimeScriptRRT Enzyme Mix 2μl，Total RNA 1μl，RNase Free dH2O 5μl。反應過程：37℃60min，85℃5s，4℃30min。

1.3.3 PCR擴增 RT-PCR的PCR擴增及溶解曲線分析均使用 ABI 7500PCR儀（Applied Biosystems）。PCR試劑采用日本Takara公司Premix Ex TaqTMⅡ，具體操作參照SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ說明書。結果按 2-ΔΔCT法分析：ΔCT=Ct（miR-195）-Ct（U6）；按ΔΔCT=ΔCT（癌組織）-ΔCT（癌旁正常組織）計算miR-195在癌組織和癌旁正常組織中表達情況，當ΔΔCT＞1，表示表達下降；-1＜ΔΔCT＜1，表示表達正常；ΔΔCT＜-1，表示表達升高，最終采用2-ΔΔCT計算相對改變倍數。

1.4 統計學處理 應用SPSS18.0統計軟件。計量資料以表示，采用配對樣本t檢驗；計數資料采用χ2檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，影響患者預后的多因素分析采用Cox回歸。

2 結果

2.1 miR-195在食管鱗癌和癌旁正常組織中的表達水平 94例食管鱗癌標本中miR-195相對癌旁正常組織為低表達45例（47.9%），正常表達39例（41.5%），高表達10例（10.6%）。采用2-ΔΔCT計算miR-195相對癌旁正常組織的表達倍數，各樣本相對表達倍數取對數（lg2-ΔΔCT）統計作圖，詳見圖1。

圖1 患者食管癌組織中相對正常組織的表達量

2.2 miR-195低表達者比例與臨床病理特征的關系miR-195低表達者比例在淋巴結有無轉移和不同腫瘤TNM分期者中的差異均有統計學意義（均P＜0.05），有淋巴結轉移者miR-195低表達者比例高于無淋巴結轉移者；Ⅰ/Ⅱ期患者miR-195低表達者比例低于Ⅲ/Ⅳ期患者。而不同年齡、性別、分化程度、腫瘤位置、浸潤程度及有無腫瘤家族史、吸煙史、飲酒史者間miR-195低表達者比例的差異均無統計學意義（均P＞0.05），詳見表1。

2.3 miR-195表達水平與預后的關系

2.3.1 miR-195表達水平與生存時間的關系 94例食管鱗癌患者按miR-195相對表達水平分為低表達組（45例）和非低表達組（49例），采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并比較兩組的無瘤生存期和危險函數，結果顯示非低表達組患者較低表達組患者有生存優勢，且低表達組患食管鱗癌的危險度較非低表達組高（P＜0.05），詳見圖2。

2.3.2 臨床病理特征、生活習慣與生存時間的關系Cox回歸分析結果顯示，miR-195的表達水平作為食管鱗癌患者預后的影響因素，風險系數為9.503（P＜0.05），表明miR-195的表達水平是影響患者生存的獨立危險因素，詳見表2。

表1 食管鱗癌組織miR-195低表達與臨床病理特征的關系

表2 影響94例食管鱗癌患者無瘤生存的多因數分析

3 討論

食管鱗癌的發生和發展是一個多因素、多步驟的過程，也是多基因發生異常表達的過程。隨著研究的進展，許多小分子生物學標志物表達的變化與食管鱗癌的發生、發展和預后密切相關，且在臨床上廣泛的應用[11]。microRNAs是一類大小約20nt，具有調控功能的內源性非編碼小分子RNA[12]。Matsushima等[13]研究發現：miR-21、miR-129、miR-373、miR-103和miR-107在食管癌細胞和組織中的表達較正常高，它們參與了食管鱗癌的增殖、轉移、侵襲、凋亡及進展，同時降低了食管鱗癌患者的生存率，表現為癌基因的功能；而miR-153、miR-100、miR-125b、miR-10a、miR-99a、miR-376a、miR-379、miR-651和miR-146b則表達下降，表現為抑癌基因的功能。因此，microRNAs與腫瘤調控的關系成為了研究的熱點。

圖2 94例食管癌患者中miR-195表達水平與患者生存和疾病危險度的關系

microRNA-195是一個位于17p13.1染色體的小分子RNA，屬于miR-15/miR-16家族，其在多種惡性腫瘤中表達下調。Wang等[7]和Xu等[8]研究均發現，miR-195在肝癌組織中的表達較正常組織的表達顯著下調。Wang等證實miR-195通過抑制VEGF、VAV2和CDC42基因的表達從而抑制肝癌細胞的血管生成和轉移。Xu等也發現miR-195使肝癌細胞阻止于G1/S期，抑制肝癌細胞的增殖和進展。Soon等[14]應用基因芯片技術研究22例腎上腺皮質癌中micorRNAs表達情況發現，miR-195在腎上腺皮質癌中的表達較腎上腺皮質瘤顯著下調。同時，miR-195的低表達降低了腎上腺皮質癌患者的生存期。Wang等[7]研究同樣發現，miR-195在85例結腸直腸癌中的表達明顯下調，且miR-195的低表達和結腸直腸癌患者的淋巴結轉移和臨床分期成負相關。同時發現miR-195最初是通過調控細胞周期發揮癌基因的功能，miR-195在體外能促進結直腸癌細胞的克隆形成和腫瘤的進展。Liu等[15]也同樣報道，miR-195通過直接調控靶基因cyclin D1和CDK6使肺癌細胞株的細胞周期阻滯于G1期，其細胞機制可能是通過Rb-E2F信號通路發揮癌基因的功能，調控多個靶基因（CCND6、CDK6、E2F3等）阻滯細胞周期從G1期向S期的轉變。因此，miR-195可能是一個細胞周期相關的microRNA，其表達下調使一系列調控周期的靶基因發揮功能，阻滯細胞周期，減少腫瘤的進展，發揮抑癌基因的功能。本研究結果與上述基本一致，在94例食管鱗癌組織標本中，miR-195相對癌旁正常組織低表達為45例，正常表達39例，高表達10例。miR-195相對癌旁正常組織低表達的患者淋巴結轉移較非低表達患者早；TNM分期Ⅲ/Ⅳ期的食管鱗癌組織中miR-195表達水平顯著低于Ⅰ/Ⅱ期食管鱗癌組織；miR-195相對癌旁正常組織低表達的患者預后較差。本研究表明miR-195相對低表達能加速腫瘤的進展，減少患者的生存時間。多因素分析也表明miR-195的表達水平是影響食管鱗癌患者生存的獨立因素。

本研究結果提示miR-195可能是一種預測食管鱗癌進展和預后指標的小分子RNA，其低表達可能促進食管鱗癌的浸潤和進展，同時使患者的預后惡化。本研究只是初步證實了miR-195的表達與食管鱗癌的臨床病理特征及預后之間的相關性，miR-195在食管鱗癌中可能發揮著抑癌基因的功能，其具體的分子生物學機制仍需要進一步的研究證實。

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（本文編輯：嚴瑋雯）

《浙江醫學》對醫學論文中有關實驗動物描述的要求

在醫學論文的描述中，凡涉及實驗動物者，在描述中應符合以下要求：（1）品種、品系描述清楚，（2）強調來源，（3）遺傳背景，（4）微生物學質量，（5）明確等級，（6）明確飼養環境和實驗環境，（7）明確性別，（8）有無質量合格證，（9）有對飼養的描述（如飼料型、營養水平、照明方式、溫度、溫度要求），（10）所有動物數量準確，（11）詳細描述動物的健康狀況，（12）對動物實驗的處理方式有單獨清楚的交代，（13）全部有對照，部分可采用雙因素方差分析。

本刊編輯部

Expression of microRNA-195 in esophageal squamous cell carcinoma and its clinical significance

Objective To investigate the expression of miR-195 in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)and its clinicopathological significance.MethodsThe expression of miR-195 in 94 ESCC samples and matched normal tissue samples was detected by real-time PCR.Results47.9%(45/94)of carcinoma samples showed low expression of miR-195,41.5% (39/94)was negatively expressed and 10.6%(10/94)showed high expression．The low expression of miR-195 was significantly correlated with lymph node metastasis,TNM staging and disease free survival.miR-195 expression level was an independent prognostic factor in patient with ESCC.ConclusionThe down-regulation of miR-195 is associated with the progression of ESCC and prognosis of the patients．

microRNA-195 ESCC DFS Tumor-suppressor

2013-11-07）

325000 溫州醫科大學附屬第一臨床學院腫瘤外科（王江峰、毛偉敏）；浙江省腫瘤醫院、浙江省腫瘤研究所（凌志強）

毛偉敏，E-mail:maowm1218@163.com