表皮生長因子受體在子宮內膜樣腺癌中的表達及意義

莊曉蘋 林瓊瓊 陳國榮 董迎

表皮生長因子受體在子宮內膜樣腺癌中的表達及意義

莊曉蘋 林瓊瓊 陳國榮 董迎

目的 研究表皮生長因子受體（EGFR）在子宮內膜樣腺癌中的表達及意義。方法采用免疫組化、原位雜交和實時熒光定量PCR方法檢測正常子宮內膜組織20例、不典型增生子宮內膜組織20例、子宮內膜樣腺癌組織60例的EGFR蛋白、mRNA和基因表達。結果子宮內膜樣腺癌組EGFR蛋白和mRNA表達高于正常子宮內膜組，差異有統計學意義（P＜0.01）；不典型增生子宮內膜組EGFR蛋白和mRNA表達高于正常子宮內膜組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；子宮內膜樣腺癌組EGFR蛋白和mRNA表達高于不典型增生子宮內膜組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。子宮內膜樣腺癌組EGFR相對表達量高于正常子宮內膜組，差異有統計學意義（P＜0.05），但不典型增生子宮內膜組和正常子宮內膜組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論EGFR的過度表達參與子宮內膜樣腺癌的發生、發展過程。

表皮生長因子受體 子宮內膜樣腺癌 免疫組化 原位雜交 實時熒光定量PCR

腫瘤的浸潤與轉移是復雜而有序的多階段生物學過程，受多種基因的調控。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一種細胞膜蛋白激酶受體，參與激活多種重要的細胞信號通路，其過度激活可以促使惡性腫瘤細胞生長、增殖和轉移，過表達或異常突變對惡性腫瘤的發生、發展、診斷及預后具有重要意義。在子宮內膜樣腺癌中，EGFR是否異常表達，目前國內已有相關文獻[1]。本研究進一步從蛋白到基因比較子宮內膜正常組織、不典型增生組織和腺癌組織中EGFR表達，探討其臨床指導意義，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2005-01—2006-12在溫州市中西醫結合醫院子宮內膜手術標本共100例，其中正常子宮內膜組織20例，不典型增生子宮內膜組織20例，子宮內膜樣腺癌組織60例。將子宮內膜樣腺癌患者按2000年國際婦產科聯盟手術病理分期標準（FIGO）進行手術分期和病理分級[2]：病理分級為Ⅰ級15例，Ⅱ級30例，Ⅲ級15級；臨床分期為Ⅰ期28例，Ⅱ期14例，Ⅲ期18例。無肌層浸潤或肌層浸潤深度≤1/2者36例，肌層浸潤深度＞1/2者24例；無淋巴結轉移者47例，有轉移者13例。

1.2 主要試劑與儀器 EGFR：ZA0505兔抗人單克隆抗體（工作濃度1∶120），二抗兔/鼠通用型工作液、DAB（1∶50稀釋液）、PBS、檸檬酸鈉緩沖液均購自上?；蚬?。EGFR探針試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。多聚賴氨酸購自SIGMA公司。Total試劑購自Invitrogen公司；石蠟包埋RNA分離和擴增試劑盒購自Ambion公司；引物設計與合成由上海生工生物工程有限公司合成。主要儀器：日本Olympus顯微鏡BX51型，日本Olympus顯微鏡攝像系統BX60型，日本Olympus熒光顯微鏡BX51型，美國H93/GSP-9050MBE隔水式電熱恒溫培養箱M388792型，美國熒光定量PCR儀ABI7500型，德國Leica切片機RM2245型，浙江臺州星星冰箱LSC-198CF型。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化檢測 采用EnVision法，常規石蠟包埋,切片厚度4μm，脫蠟，依次浸泡于不同濃度乙醇中，蒸餾水洗滌；3%過氧化氫室溫孵育20min以消除內源性過氧化物酶；蒸餾水沖洗，PBS液浸泡5min×3次；微波爐抗原修復：0.01mmol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）作為抗原修復液，PBS浸泡5min×3次；滴加適當稀釋的一抗（EGFR 1∶120），4℃孵育過夜后，PBS浸泡5min×3次，滴加二抗，室溫孵育20min，PBS浸泡5min×3次；DAB顯色5min；自來水充分沖洗，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.3.2 原位雜交方法 本研究每一個標本溶解曲線呈單峰，內參位于18～25，說明標本均能達到實驗標準。（1）雜交前組織處理：全部子宮內膜組織石蠟標本均制備為4μm切片，置于經多聚賴氨酸處理過的載玻片上，60℃烘烤20min，確保貼片牢固。石蠟切片經常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水后，使用0.3%過氧化氫室溫處理10min，以滅活組織內固有的過氧化物酶，蒸餾水洗5min×3次；隨后加入3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶K室溫消化30min。經0.01M PBS洗5min×3次后用1%多聚甲醛固定10min，含有1/1 000DEPC。（2）原位雜交方法：以上切片經蒸餾水洗3次后加入預雜交液，恒溫箱38～42℃作用2～4h以封閉非特異結合點。按每張切片20μl滴加雜交液，將玻片置于濕盒中（盒底保濕可用DEPC水），38～42℃恒溫孵育15h左右（時間過長易產生較高背景）；同時設立省略探針的空白對照，以上操作需在無RNA酶環境中進行。雜交后洗片（2×SSC、37℃5min×3次；0.5×SSC、37℃5min×2次；0.2×SSC、37℃5min× 2次），后加入封閉液37℃30min；滴加FITC標記地高辛抗體37℃60min，經PBS洗5min×4次后；玻片自然干燥后滴加10μl二脒基苯基吲哚（DAPI）復染液封片20min。

1.3.3 實時熒光定量PCR法 （1）石蠟包埋組織RNA的提?。孩偈灠駱颖久撓灒簩⒍妆郊尤肭衅校覝胤跤?0min，顛倒混勻，使石蠟充分溶解。無水乙醇洗滌2遍，去掉殘余的二甲苯，干燥片狀沉淀物。②石蠟包埋樣本RNA提取及純化：按照RecoverAllTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE試劑盒說明操作提取總RNA。③RNA溶解：純化后的RNA用60U/L Elution溶解，分裝20μl用于檢測RNA質量和逆轉錄，其余-80℃保存備用。（2）新鮮組織RNA的提取：采用液氮研磨法將組織磨成粉末，加入Trizol混合，按Trizol說明書抽提總RNA。（3）引物設計與合成：采用在線Primer 3.0軟件設計引物，GC含量40%～60%，產物大小89～203bp，采用Oligo 6.0軟件評估，引物均跨內含子以減少基因組DNA的干擾。（4）實時熒光定量PCR檢測不同組織中EGFR表達量：引物EGFR（221bp）：上游5′-CCAGTGTGCCCACTACATTG-3′，下游5′-CGCTGCCATCATTACTTTGA-3′GAPDH（314bp）；上游5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′，下游5′-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′。反應在25 μl的體系中進行，其中2×QuantiTect SYBR Green PCR 12.5μl、10μM的上下游引物各1μl、樣本cDNA 2μl（300ng）、RNA酶滅活水8.5μl。熱循環如下：94℃、5 min；94℃、30s，57℃、30s，72℃、60s，40個循環；72℃、10min。

1.4 結果判定

1.4.1 免疫組化 EGFR蛋白表達于細胞質或細胞膜，細胞質或細胞膜不著色為陰性，淡棕色顆粒為弱陽性，棕黃色顆粒為陽性，深棕黃色顆粒為強陽性，說明該蛋白過表達。切片在光鏡下測量采用高倍鏡選取子宮內膜樣腺癌組織、正常子宮內膜組織，進行數碼拍照（統一焦距及光強），在所需區域隨機拍攝5個高倍視野，用Image pro plus 6.0圖像分析軟件分析，準確分割陽性區域后，測量累積光密度總和（IOD sum），以及陽性區域面積總和（Area sum），兩者之商（IOD sum/A rea sum），即為單位面積平均光密度（OD）值，最后再以同一切片5個視野的平均光密度的均數作為該切片所代表樣本EGFR蛋白表達強度。

1.4.2 原位雜交（ISH） 在熒光顯微鏡下選用特異的單通道濾波片觀察細胞核。綠色熒光為目的基因染色，細胞核由DAPI復染成藍色。測定為綠色信號位于細胞質內，核呈藍色。缺省探針及抗體的陰性對照無此沉淀。切片熒光顯微鏡下均采用高倍鏡進行數碼拍照（統一焦距及光強），在所需區域隨機拍攝5個高倍視野，用Image pro plus 6.0圖像分析軟件分析，準確分割陽性區域后，測量累積光密度總和，以及陽性區域面積總和，兩者之商即為單位面積平均光密度（OD）值，最后再以同一切片5個視野的平均光密度的均數作為該切片所代表樣本EGFR mRNA的表達強度。

1.4.3 實時熒光定量PCR檢測石蠟包埋組織中EGFR基因表達量 選擇適宜的基線，各熒光曲線與基線的交叉點即為Ct值，同一基線下Ct值越小，其熒光信號也就最先到達某閾值而被檢測到，表明其基因拷貝數越多。應用2-ΔΔCt法[2]分析目的基因和內參基因的Ct值，以GAPDH作為內參基因，正常子宮內膜組織作為對照組，EGFR相對表達量公式計算：folds=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內參照基因）研究組-（Ct目的基因-Ct內參照基因）對照組，通過計算子宮內膜組織中EGFR mRNA相對于正常子宮內膜組織的表達性差異。

1.5 統計學處理 采用SPSS 15.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 EGFR蛋白在不同子宮內膜組織的表達 EGFR蛋白在細胞質或細胞膜表達。正常子宮內膜表達陰性，即細胞質或胞膜不著色（圖1）；不典型增生子宮內膜表達弱陽性，即細胞質或胞膜淡棕色顆粒（圖2）；子宮內膜樣腺癌表達強陽性，即細胞質或胞膜深棕黃色顆粒棕（圖3）。子宮內膜樣腺癌組EGFR蛋白表達高于正常子宮內膜組，差異有統計學意義（P＜0.01）；不典型增生子宮內膜組EGFR蛋白表達高于正常子宮內膜組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；子宮內膜樣腺癌組EGFR蛋白表達高于不典型增生子宮內膜組，但差異無統計學意義（P＞0.05），詳見表1。

2.2 EGFR mRNA在不同子宮內膜組織的表達 EGFR mRNA在正常子宮內膜、不典型增生子宮內膜、子宮內膜樣腺癌細胞質中呈不同程度陽性表達（間質細胞不表達）。正常子宮內膜主要以陰性（圖4）或弱陽性表達，不典型增生子宮內膜主要以弱陽性（圖5）或陽性表達、子宮內膜樣腺癌主要以強陽性（圖6）或陽性表達。子宮內膜樣腺癌組EGFR mRNA表達高于正常子宮內膜組，差異有統計學意義（P＜0.01）；不典型增生子宮內膜組EGFR mRNA表達高于正常子宮內膜組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；子宮內膜樣腺癌組EGFR mRNA表達高于不典型增生子宮內膜組，但差異無統計學意義（P＞0.05），詳見表2。

圖1 正常子宮內膜EGFR蛋白陰性表達（EnVision法，×200）

圖2 不典型增生子宮內膜EGFR蛋白弱陽性表達（EnVision法，×200）

圖3 子宮內膜樣腺癌EGFR蛋白強陽性表達（EnVision法，×200）

表1 不同子宮內膜組織EGFR蛋白表達情況

表2 不同子宮內膜組織EGFR mRNA表達

2.3 EGFR基因在不同子宮內膜組織的表達 以正常子宮內膜為對照組，計算得出病變子宮內膜組織EGFR相對表達量；結果示EGFR相對表達量符合正態分布，不典型增生子宮內膜組和子宮內膜樣腺癌組平均值分別為0.98±0.28、1.89±0.17，子宮內膜樣腺癌組與正常組比較差異有統計學意義（P＜0.05），但不典型增生子宮內膜組和正常子宮內膜組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

EGFR是I型跨膜酪氨酸激酶生長因子受體，廣泛分布于哺乳動物除血管外的上皮細胞膜上。EGFR結合相應配體后使酪氨酸殘基磷酸化，酪氨酸磷酸化可活化Ras，將細胞信號由細胞表面轉至細胞核內介導DNA合成及細胞增殖效應。根據細胞的具體環境不同，某些配體如EGF、TGF-α、AR表達出對細胞增殖調節的雙向性。研究表明，多種人類腫瘤的發生與EGFR家族的異常表達有關。常見的有EGFR信號系統受體的過量表達和（或）受體的突變[3]，造成非受體依賴的酪氨酸蛋白激酶活性改變、異常的細胞內分布及穩定性增加。生理情況下，EGFR與受體結合使Src同源2區蛋白磷酸化，誘導正常的有絲分裂反應。EGFR過量表達時可見到基因擴增和重排，并且EGFR過量表達時，其底物如磷脂酶C和Ras-GAP轉變為磷酸化狀態，促進了腫瘤的形成和發展。EGFR已被確定為細胞生長和繁殖過程中至關重要的啟動因素。目前的研究發現，EGFR信號傳導的增強能引起細胞無限制地生長繁殖，而且還能影響腫瘤生長過程中的其他多種重要因素，如細胞的增殖、分化、浸潤以及血管新生等[4]。EGFR的表達異常，可導致正常細胞惡性轉化，并增加腫瘤細胞的侵襲、遠處轉移能力。

圖4 正常子宮內膜EGFR mRNA陰性表達（ISH，×1 000）

圖5 不典型增生子宮內膜EGFR mRNA細胞質弱陽性表達（ISH，×1 000）

圖6 子宮內膜樣腺癌EGFR mRNA細胞質強陽性表達（ISH，×1 000）

據文獻報道，EGFR在許多實體腫瘤如非小細胞肺癌、頭頸部鱗癌、乳腺癌、胃腸癌、胰腺癌、卵巢癌及前列腺癌等上皮源性腫瘤中呈現高表達或異常表達，并在其發生、發展中起著重要作用[5-7]。本研究結果表明，與正常子宮內膜組織比較，EGFR基因和蛋白在子宮內膜樣腺癌組織中均有過表達，以上結果與文獻報道一致[8]。而不典型增生子宮內膜組織，EGFR基因和蛋白表達高于正常子宮內膜組織，低于子宮內膜樣腺癌組織的趨勢，但差異無統計學意義。綜合分析上述結果，EGFR的表達隨著子宮內膜病變的進展呈現逐漸強化趨勢，即EGFR表達越高，其組織惡變的程度也越高。這個可能和EGFR促進了腫瘤細胞的進一步的分裂增殖有關。因而我們對子宮內膜樣腺癌中EGFR表達的研究對判斷子宮內膜樣腺癌的預后有一定的意義，即對于判斷手術切除范圍及化療方案的選擇和放療的耐受以及預后不良可起到指導作用，為腫瘤的治療提供了一個理想的分子靶點[9]。

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Expression of EGFR in endometrial adenocarcinoma and its clinical significance

Objective To investigate the expression of EGFR in endometrial adenocarcinoma and its clinical significance.MethodsThe expression of EGFR protein and mRNA were detected by immunohistochemistry,in situ hybridization and real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction(QRT-PCR)respectively,in 20 cases of normal endometrium,20 cases of atypical endometrial hyperplasia and 60 cases of endometrial adenocarcinoma.ResultsThe expressions of EGFR protein and mRNA were higher in endometrial adenocarcinoma than those in normal endometrium(P＜0.01).There were no significant differences in expression of EGFR protein and mRNA both between normal endometrium and atypical endometrial hyperplasia,and between adenocarcinoma and atypical hyperplasia(P＞0.05).ConclusionThe over-expression of EGFR may be involved in the occurrence and development of endometrial adenocarcinoma.

Epidermal growth factor receptor Endometrial adenocarcinoma Immunohistochemistry In situ hybridization QRT-PCR

2013-06-05）

（本文編輯：嚴瑋雯）

浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2010KYA175）

325000 溫州市中西醫結合醫院病理科（莊曉蘋、董迎）；溫州醫科大學附屬第二醫院病理科（林瓊瓊）；溫州醫科大學附屬第一醫院病理科（陳國榮）

莊曉蘋，E-mail：tingyuxuan56@126.com