針刺介入時機對腦梗死大鼠能量代謝和腦源性神經生長因子、酪氨酸激酶受體B的影響

劉勇，趙軍，王洪，張韌

(1.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱150040;2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院)

針刺療法廣泛地應用于腦梗死的臨床治療，具有擴張血管、改善腦及肢體的血液循環、激活神經細胞、使運動神經元的功能恢復等作用。研究表明，針刺可促進腦梗死患者神經功能的康復，而且開始治療越早越好，但最佳時間點尚無定論［1］。本研究采用頸內動脈線栓法制備大鼠局灶性永久性大腦中動脈阻塞模型(pMCAO)，設立不同時間點開始針刺治療，討論不同時間點給予針刺治療對腦梗死大鼠腦組織的能量代謝及腦源性神經因子(BDNF)和酪氨酸激酶受體B(TrKB)陽性神經細胞表達的影響，尋找針刺治療的最佳介入時機。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 選用SPF級健康雄性SD大鼠，2月齡，體質量280～300 g，購于黑龍江中醫藥大學實驗動物中心(許可證號:SCXK黑2008004)。采用隨機數字表法將SD大鼠分為5組:假手術組、模型組、2 h針刺組、3 d針刺組和7 d針刺組，每組各40只，各組又分為1、3、7、14 d，4 個亞組每組各10 只。

1.2 動物模型的制備 采用頸內動脈線栓法制備大鼠局灶性永久性腦缺血模型［2］。雄性SD大鼠麻醉后仰位固定，行頸前正中縱行切口，鈍性分離皮下組織和肌肉，暴露左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)，游離并保護迷走神經，在CCA近心端和遠心端及ECA掛線備用，用微動脈夾暫時夾閉ICA，然后在近心端結扎CCA、ECA。在距離CCA分叉處4 mm處剪一小切口，將栓線輕輕插入ICA，將繞在CCA遠端的細線輕輕系緊，將拴線向ICA方向輕推，從ICA分叉處計算，插入深度在18 mm時，牢牢系緊CCA遠心端的細線，縫合肌肉和皮膚。手術后大鼠出現右側肢體的癱瘓，提尾懸空時出現右側上肢的屈曲，或行進時向右側轉圈、傾斜，則提示造模成功，入選試驗。假手術組除不栓塞大腦中動脈外，余處理同缺血組。

1.3 針刺操作

1.3.1 2 h、3 d和7 d針刺組 動物于造模后分別于2 h、3 d和7 d，予針刺治療。取穴:參照《實驗針灸學》［3］取患肢對側百會透曲鬢穴，進針約 0.8 mm，留針30 min，期間捻轉3次，每次1 min;雙側風池穴、患肢的內關穴、足三里穴，進針約0.5 mm，留針30 min，期間行提插捻轉3次，每次1 min，1次/d。分別于1 d、3 d、7 d、14 d 隨機選取10 只大鼠，在進行神經功能測定后，斷頭法處死大鼠，留取檢測標本。

1.3.2 假手術組、模型組大鼠 與針刺組相同時間不針刺，但抓取并捆綁固定，時間、條件同針刺組。

1.4 主要儀器與試劑 ATP酶測試盒(南京建成生物工程研究所);752型紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);兔抗大鼠BDNF、TrKB多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，貨號BA0565-1、BA0623;0.3 mm ×13 mm 華佗牌毫針(蘇州醫療器械廠)。

1.5 腦組織標本采集及指標的測定 在相應的時間點，將大鼠斷頭處死，取左腦去掉嗅球、小腦及延髓，加4倍預冷的生理制備成10%的腦組織溶液，混勻，3 500 r/min離心10 min，取上清液定磷，采用比色法測定ATP酶含量，計算鈉，鉀-三磷酸腺苷酶(Na+，K+－ATP 酶)、鈣，鎂-三磷酸腺苷酶(Ca2+，Mg2+－ATP 酶)的活性［4］。

每組取10只大鼠，心臟灌注，取腦，取視交叉前2 mm至視交叉后2 mm的腦組織以保證腦梗死區域包含其中，甲醛固定24 h，脫水、透明、石蠟包埋，連續冠狀位切片，片厚5 μm。烘干20 h，備用。用免疫組織化學法染色后，高倍鏡下隨機選取6個視野，觀察計算BDNF、TrKB陽性細胞數。

1.6 統計學處理 運用SPSS 13.0軟件進行數據統計分析，正態分布定量數據多組間均值比較采用單因素方差分析(LSD法)。

2 結果

2.1 不同針刺治療時機對大鼠腦組織中Na+，K+－ATP酶、Ca2+和Mg2+－ATP酶活性的影響 與假手術組比較，腦梗死大鼠腦組織中Na+，K+－ATP酶和Ca2+，Mg2+－ATP酶活性下降(P＜0.01)，有先升后降的變化趨勢。不同時間點Na+，K+－ATP酶活性的比較:①1 d和3 d時:2 h組分別與模型組、3 d組、7 d組比較，差異有統計學意義(P＜0.05);模型組、3 d組、7 d組分別比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。②7 d和14 d時:2 h組與模型組、7 d組比較，差異有統計學意義(P＜0.01);2 h與3 d組、3 d與7 d組、3 d與模型組比較，差異均有統計學意義(P＜0.05);7 d組與模型組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。

不同時間點Ca2+，Mg2+－ATP酶活性比較:①1 d和3 d時:2 h組分別與模型組、3 d組、7 d組比較，差異有統計學意義(P＜0.01);模型組、3 d組，7 d組分別比較，差異無統計學意義(P＞0.05)②7 d時:2 h組與模型組、7 d組比較，差異均有統計學意義(P＜0.01);2 h與3 d組、3 d與7d組、3 d組與模型組比較，差異有統計學意義(P＜0.05);7 d組與模型組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。③14 d時:2 h組分別與模型組、7 d組比較，差異有統計學意義(P＜0.01);2 h與3 d組;3 d、7 d針刺組分別與模型組比較，差異有統計學意義(P＜0.05);3 d與7 d組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1，2。

2.2 不同針刺介入時機對腦梗死模型大鼠腦組織中BDNF、TrKB陽性細胞數的影響 假手術組大鼠腦組織內僅有少量表達，3個針刺組和模型組在不同時間點的BDNF、TrKB陽性神經細胞數比假手術組明顯增多，差異有統計學意義(P＜0.01)。模型組大鼠隨著時間的延長BDNF、TrKB陽性神經細胞數有增多的趨勢(P＜0.01)。

不同針刺時間點腦梗死大鼠BDNF、TrKB陽性神經細胞數比較:①1 d和3 d時:2 h組分別與模型組、3 d、7 d組比較，差異有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01);模型組、3 d組、7 d組之間分別比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。②7 d時:2 h組與模型組、7 d組比較，差異均有統計學意義(P＜0.01);2 h與3 d組;3 d分別與7 d組、模型組比較，差異均有統計學意義(P＜0.05);7 d組與模型組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。③14 d時:2 h分別與7 d組、模型組比較，差異有統計學意義(P＜0.01);2 h與 3 d組;3 d與 7 d組 ;3 d、7 d組分別與模型組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表 3，4。

表1 不同針刺介入時機對各組大鼠腦組織Na+，K+－ATP酶活性的影響(±s，μmolPi/mgprot/hour，n=10)

表1 不同針刺介入時機對各組大鼠腦組織Na+，K+－ATP酶活性的影響(±s，μmolPi/mgprot/hour，n=10)

注:與假手術組比較，aP＜0.01;與2 h針刺組比較，bP＜0.05，dP＜0.01;與模型組比較，cP＜0.05，eP＜0.01

組別5.93 ±0.63 5.69 ±0.91 5.74 ±0.83 6.01 ±0.23模型組 2.75 ±0.43ab 3.34 ±1.01ab 2.80 ±0.63ad 2.70 ±0.56ad 2 h 針刺組 3.50 ±0.61c 4.92 ±0.97c 4.88 ±0.24e 4.71 ±0.87e 3 d 針刺組 2.70 ±0.72b 3.61 ±0.81b 3.86 ±0.57bc 3.92 ±0.69bc 7 d 針刺組 2.69 ±0.56b 3.15 ±0.43b 3.17 ±0.37d 3.18 ±0.58d F值1 d 3 d 7 d 14 d假手術組2.012 1.084 6.891 2.414 P值0.005 0.002 0.000 0.000

表2 不同針刺介入時機對各組大鼠腦組織Ca2+，Mg2+－ATP酶活性的影響(±s，μmolPi/mgprot/hour，n=10)

表2 不同針刺介入時機對各組大鼠腦組織Ca2+，Mg2+－ATP酶活性的影響(±s，μmolPi/mgprot/hour，n=10)

注:與假手術組比較，aP＜0.01;與2 h針刺組比較，bP＜0.01，dP＜0.05;與模型組比較，cP＜0.01，eP＜0.05

組別3.27 ±0.23 3.25 ±0.29 3.21 ±0.33 3.39 ±0.14模型組 1.36 ±0.36ab 2.19 ±1.01ab 1.81 ±0.47ab 1.68 ±0.53ab 2 h 針刺組 2.37 ±0.51b 3.24 ±0.71b 3.19 ±0.69c 3.21 ±0.54c 3 d 針刺組 1.35 ±0.27b 2.54 ±0.59b 2.51 ±0.38de 2.68 ±0.41de 7 d 針刺組 1.41 ±0.44b 2.23 ±0.89b 1.97 ±0.27b 2.24 ±0.93e F值1 d 3 d 7 d 14 d假手術組2.007 2.024 2.155 1.038 P值0.000 0.009 0.000 0.000

表3 不同針刺介入時機對各組大鼠BDNF陽性神經細胞數量的影響(±s，個/視野，n=10)

表3 不同針刺介入時機對各組大鼠BDNF陽性神經細胞數量的影響(±s，個/視野，n=10)

注:與假手術組比較，aP＜0.01;與2 h針刺組比較，bP＜0.05，dP＜0.01;與模型組比較，cP＜0.05，eP＜0.01

組別2.44 ±0.23 2.41 ±0.31 2.39 ±0.47 2.47 ±0.35模型組 4.45 ±2.13ab 7.20 ±1.11ab 11.16 ±2.90ad 15.06 ±2.07ad 2 h 針刺組 6.08 ±4.16c 11.85 ±2.49c 17.78 ±3.15e 24.12 ±3.53e 3 d 針刺組 4.45 ±2.13d 7.27 ±2.11d 14.19 ±2.25bc 20.11 ±2.99bc 7 d 針刺組 4.45 ±2.13d 7.09 ±2.36d 12.02 ±2.19d 17.22 ±0.87cd F值1 d 3 d 7 d 14 d假手術組3.814 5.032 1.180 2.908 P值0.003 0.000 0.000 0.000

表4 不同針刺介入時機對各組大鼠TrKB陽性神經細胞數量的影響(±s，個/視野，n=10)

表4 不同針刺介入時機對各組大鼠TrKB陽性神經細胞數量的影響(±s，個/視野，n=10)

注:與假手術組比較，aP＜0.01;與2 h針刺組比較，bP＜0.05，dP＜0.01;與模型組比較，cP＜0.05，eP＜0.01

組別2.73 ±0.23 2.69 ±0.28 2.77 ±0.37 2.80 ±0.45模型組 4.95 ±1.73ab 10.30 ±1.11ab 12.75 ±2.10ad 19.43 ±1.67ad 2 h 針刺組 7.57 ±1.08c 20.25 ±4.09c 22.98 ±3.36e 29.03 ±4.22e 3 d 針刺組 4.88 ±0.78d 10.99 ±1.28d 17.17 ±3.25bc 23.39 ±3.35bc 7 d 針刺組 5.07 ±0.8d 11.01 ±1.02d 12.99 ±2.33d 17.19 ±2.16cd F值1 d 3 d 7 d 14 d假手術組2.565 13.577 2.560 6.385 P值0.001 0.000 0.000 0.000

3 討論

針刺能夠有效改善腦梗死大鼠的神經功能，已經在臨床中得到了有效的證實。本研究中作者根據多年臨床經驗結合中醫傳統理論，頭部腧穴選取百會透曲鬢，這種取穴方法在頭部橫跨頂、額、顳3區，并有督脈、膀胱經、膽經3條陽經貫穿，具有統調一身之陽氣、醒腦開竅的功能，并能鼓動頭部經氣的運行，通達全身經絡系統。從解剖學和電生理角度來看，針刺產生的生物電效應傳送到大腦的運動區和感覺區的皮質，提高缺血區神經細胞的興奮性，改善皮層的腦血液循環，腦代償功能加強，功能得到改善［5-6］。對癥選取癱瘓肢體的內關穴和足三里穴可促進癱瘓肢體肌力的提高，改善患肢功能。

腦梗死后，首先發生的是腦血流量的減少和能量衰竭，能量耗竭是缺血后細胞損傷的始動因素［7］。ATP酶是一種蛋白酶，其活性改變是缺血后神經細胞繼發性損傷的重要環節，Na+－K+－AT酶和Ca2+，Mg2+－ATP酶是依賴ATP直接供能的酶，它們的活性增強表明ATP酶增多，能量代謝的增強，活性減低表明能量代謝能力下降。因此，把ATP酶的活力作為能量代謝檢測的主要指標。

BDNF廣泛分布于大腦中，在維持神經細胞功能、防止神經細胞退行性改變以及修復再生等多方面發揮著重要的作用，是大腦中含量最多的神經營養因子;研究表明，BDNF參與腦缺血性損傷的保護過程［8］，可以保護神經細胞，抵抗缺血性損傷，保護缺血半暗帶的神經細胞，減少梗死面積，抑制遲發性神經細胞的壞死。TrKB是BDNF的高親受體，當BDNF與其相結合后，形成的二聚體同時完成自身磷酸化，通過細胞轉導發揮其生物學效應，促神經細胞的存活、修復再生，對腦缺血損傷的神經細胞有明顯的保護作用。

本研究在大鼠腦缺血后2 h、3 d、7 d三個時間點分別開始針刺，分4個不同時間點觀察對缺血腦組織能量代謝的影響。腦梗死后，缺血腦組織ATP酶受到抑制，生成減少，大鼠腦組織的Na+，K+－ATP酶，Ca2+，Mg2+－ATP酶活性急劇下降，1 d時最低，隨著時間的延長出現先升在降的變化趨勢，這可能與腦缺血損傷機制的復雜化有關。2 h針刺組、3 d針刺組、7 d針刺的ATP酶活性在相應的時間點較模型組均有不同程度的升高，且2 h組高于3 d組和7 d組，提示針刺可顯著改善缺血腦組織的能量代謝，恢復 Na+，K+－ATP酶、Ca2+，Mg2+－ATP酶的活性，發揮腦保護的作用，而且早期介入針刺的效果更好。

［1］ 李嫚，方媛.不同時間窗電針治療對腦梗死大鼠Bcl-2和BDNF表達的影響［J］.中風與神經疾病雜志，2009，26(5):603-605.

［2］ 溫浩，侯月梅.人類疾病動物模型研究和實驗動物管理［M］.北京:科學出版社，2012:137-138.

［3］ 李忠仁.實驗針灸學［M］.北京:中國中醫藥出版社，2007:219-253.

［4］ 喬琳，胡彬，劉勇.兩種神經功能評分評價大鼠局灶性腦缺血模型的初步研究［J］.山西醫科大學學報，2012，43(12):893-895.

［5］ 孔瑩，鄒偉，喬勝楠，等.“百會透曲鬢”針刺法對腦出血模型大鼠腦組織IL-6蛋白表達影響的實驗研究［J］.中醫藥信息，2012，29(2):86-88.

［6］ 王渝蓉，楊健，曾可斌.針刺治療對急性腦梗死患者神經功能及血清超敏 C反應蛋白水平的影響［J］.中國臨床保健雜志，2012，15(4):420-421.

［7］ 劉明，孫建寧，董世芬.大鼠腦缺血不同時間腦能量代謝的變化研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17(5):216-218.

［8］ 王彥春，梁少榮.電針對局灶性腦缺血大鼠皮層BDNF、TrKB 的影響［J］.中華中醫藥學刊，2012，30(3):469-471.