薯蕷皂苷元體內外抑制胃癌增殖的機制

霍中華，胡君，儲著陵，呂勝，尹鵬，章麗

（解放軍第454醫院普外科，江蘇南京210002）

薯蕷皂苷元體內外抑制胃癌增殖的機制

霍中華，胡君，儲著陵，呂勝，尹鵬，章麗

（解放軍第454醫院普外科，江蘇南京210002）

目的：研究薯蕷皂苷元抑制胃癌增殖及轉移的主要途徑及其機制。方法：分別使用1，10，100μg／mL濃度薯蕷皂苷元處理人血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）和胃癌BGC-823細胞，制作細胞生長曲線，觀察薯蕷皂苷元對細胞增殖能力的影響；選取一定濃度的薯蕷皂苷元處理HUVEC和BGC-823細胞，體外成管實驗和劃線法分別檢測藥物處理對血管內皮細胞成管能力及腫瘤細胞遷移能力的影響。將BGC-823細胞接種到裸鼠制作皮下腫瘤模型，連續靜脈注射薯蕷皂苷元，分析比較其對皮下腫瘤的抑制效果。結果：與對照組比較，薯蕷皂苷元可明顯抑制內皮細胞增殖活性（P＜0．05），且具有濃度依賴性；而相同處理方式對BGC-823細胞的增殖活性基本無影響；10μg／mL的薯蕷皂苷元對BGC-823細胞的遷移能力具有明顯的抑制作用，能夠明顯抑制HUVEC細胞體外成管能力；與模型組比較，薯蕷皂苷元給藥組腫瘤抑制率明顯增高（達38．2%），差異有統計學意義（P＜0．05）。結論：薯蕷皂苷元可以通過抑制內皮細胞增殖活性影響腫瘤血供，并最終抑制皮下腫瘤模型的增殖，同時，其可通過直接的作用抑制胃癌的遷移。

薯蕷皂苷元；人血管內皮細胞；BGC-823細胞；增殖活性；體外成管；遷移；裸鼠成瘤

胃癌的發病率近年來呈現年輕化、擴大化的趨勢，然而多年來，其治療手段卻沒有根本性的改變［1］，外科手術配合化學療法是目前胃癌治療的主要手段。手術療法受到患者具體情況的限制，化學療法也始終伴隨著嚴重的不良反應。化學藥物的大量長期使用，還有可能導致染色體畸形，具有臟器損害及致畸等潛在危險。因此，近年來天然植物成分逐漸成為抗腫瘤領域研究的熱點。薯蕷皂苷是從薯蕷科植物穿龍薯蕷的根中分離出的一種植物甾體化合物，其抗癌活性首先發現于云南白藥［2］。而Chiang等［3］則通過實驗證實從紫花茄中提取的薯蕷皂苷對結腸癌、鼻咽癌、宮頸癌等多種腫瘤細胞具有抑制作用。王麗娟等［4］研究了薯蕷皂苷在體內外的抗腫瘤作用，結果發現其對肉瘤、肝癌、宮頸癌細胞及裸鼠皮下移植瘤均有明顯抑制作用。HU等［5］則系統觀察了薯蕷皂苷元的抗癌作用，發現薯蕷皂苷元對大多數血癌和實體瘤都表現出抑制活性。近期研究發現，薯蕷皂苷元可以抑制多種腫瘤細胞的侵襲和轉移能力［6－8］，這種抑制能力可能是通過抑制缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF1-α）的活性實現的［9－10］。

薯蕷皂苷元對血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的影響，以及是否通過對血管生成的影響進而影響腫瘤的形成及發展過程，目前未見有詳細報道。本研究比較了薯蕷皂苷對血管內皮細胞和胃癌細胞生物學功能的影響，且建立了裸鼠胃癌模型，初步分析薯蕷皂苷是否通過影響血管生成進而影響胃癌形成和發展，以及可能存在的作用機制。

1 材料與方法

1．1 材料

HUVEC細胞購自上海肯強生物科技有限公司，BGC-823細胞購于中科院細胞所；基質膠、細胞培養耗材為BD公司產品；胎牛血清，0．25%胰蛋白酶，RPMI-1640培養基均為Invitrogen公司產品；CCK-8細胞活性檢測試劑盒為日本同仁化學研究所產品；細胞培養箱為日本三洋公司產品，移液器、離心機為Eppendorf公司產品；酶標儀為Thermo公司產品；裸鼠購于上海斯萊克實驗動物有限公司；倒置顯微鏡為Olympus公司產品；薯蕷皂苷元為美國圣克魯斯生物技術公司產品。

1．2 方法

1．2．1 薯蕷皂苷元對胃癌BGC-823細胞及HUVEC增殖活性的影響 取對數生長期BGC-823及HUVEC細胞，胰酶消化法制備細胞懸液，血細胞計數板計數活細胞，使用添加10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養基調整細胞密度至1×105個／mL，接種細胞至96孔細胞培養板，每孔100μL細胞懸液。實驗分為對照組和實驗組，其中實驗組培養基中加入終濃度為1、10和100μg／mL的薯蕷皂苷元。接種后正常條件培養24、48及72 h，CCK-8檢測細胞活性。每孔加入10μL的CCK-8溶液，置于37℃和5%CO2培養箱內繼續培養4 h，用酶標儀測定450 nm處的光密度值。

1．2．2 薯蕷皂苷元對BGC-823細胞遷移能力的影響 取對數生長期BGC-823細胞，胰酶消化法制備細胞懸液，臺盼藍染色后使用血小球計數板計數活細胞數，使用完全培養基（RPMI-1640＋10%FBS）調整細胞密度為1×105個／mL，接種細胞到6孔板，每孔添加2 mL細胞懸液，37℃和5%CO2濃度下培養24 h，使用無菌200μL槍頭劃痕，無血清培養液沖洗2次，加入不含血清的培養液2 mL，正常條件培養；劃線后24、48和72 h分別進行顯微鏡攝影，觀察細胞遷移狀況。實驗分為對照組和實驗組，其中實驗組培養基中加入終濃度為1、10和100μg／mL的薯蕷皂苷元。

1．2．3 薯蕷皂苷元對HUVEC成管的影響 實驗的前1天，將基質膠置于4℃融化，同時將滅菌的10μL槍頭、24孔細胞培養板置于4℃冷藏備用。實驗時，從冰箱中取出冷藏的槍頭和培養板，在培養板每個孔中加入100μL基質膠，注意保持槍頭垂直于孔中間位置，基質膠一直保持放在冰上。輕晃培養板使膠分布均勻，將培養板放入培養箱中，放置30 min使膠凝固。在膠凝固的過程中，可以開始準備細胞懸液，細胞消化后將細胞懸液密度調整到2×105個／mL。從培養箱中取出培養板，每孔加入50μL細胞懸液，蓋上蓋子后放入培養箱培養，6 h后進行顯微鏡攝影，每組任選5個視野，計算其中閉合狀結構的數目，求取平均值后進行組間比較。

1．2．4 薯蕷皂苷元對胃癌細胞裸鼠模型的影響取對數生長期BGC-823細胞，胰酶消化法制備細胞懸液，1 000×g離心2 min收集沉淀，使用DPBS重懸細胞2次，再用DPBS制備細胞懸液，臺盼藍染色后使用血細胞計數板進行活細胞計數，并使用DPBS調整細胞密度至1×108個／mL，冰浴保存。無菌1 mL注射器吸取0．1 mL細胞懸液，接種到5周齡裸鼠腋下。接種后第10天，皮下可見有瘤體形成，直徑約2．5 mm。給藥組通過尾靜脈注薯蕷皂苷元，每次用量為50 mg／kg（根據臨床人體使用量的10倍給藥），每2天注射1次，直至接種后第4周，共注射7次。拉頸處死小鼠，剝離腫瘤（去掉瘤體上的脂肪及血管、淋巴管組織），進行瘤體稱重，計算腫瘤抑制率。

1．3 統計學處理

采用SPSS 13．0統計軟件分析，數據結果采用均數±標準差表示，采用析因分析進行組間差異及組內差異的比較。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 薯蕷皂苷元對胃癌細胞及HUVEC增殖活性的影響

比較不同處理組細胞生長曲線發現，1，10，100μg／mL的薯蕷皂苷元可明顯抑制HUVEC細胞增殖活性，且具有濃度依賴性；其中48和72 h，與對照組比較，差異具有統計學意義（P＜0．01或P＜0．05）；而同樣濃度的薯蕷皂苷元處理，對BGC-823增殖活性則無明顯影響。見圖1。

2．2 薯蕷皂苷元對胃癌細胞BGC-823遷移能力的影響

按照前面的活性抑制實驗，選擇最低有效濃度10μg／mL的薯蕷皂苷元進行遷移實驗。通過比較同一視野細胞向線內遷移的速度，發現薯蕷皂苷元能明顯抑制BGC-823細胞的遷移能力。見圖2。

2．3 薯蕷皂苷元對HUVEC體外成管的影響

HUVEC經10μg／mL的薯蕷皂苷元處理后，與對照組比較，成管數量明顯降低，差異具有統計學意義（χ2＝2．91，P＜0．05）。結果顯示，薯蕷皂苷元可明顯抑制HUVECDE成管能力。見圖3

2．4 薯蕷皂苷元對裸鼠皮下胃癌模型的影響

與模型組比較，給藥組腫瘤明顯受到抑制，其抑制率達到38．2%（χ2＝3．31，P＜0．05）；鹽水對照組與模型組比較，抑制率無明顯差異。見圖4。

3 討論

腫瘤從某種意義上來說是系統疾病的局部表現，使用單一的療法，很難根治。而以目前腫瘤治療的主要手段來看，手術切除、化療放療均會產生比較明顯的不良反應。另外，術后復發的問題也一直困擾著醫療人員和患者。天然藥物因其低毒副作用，可以作為腫瘤治療和輔助治療的有效藥物。近年來發現多種植物及其有效成分具有抑制腫瘤的作用。如人參苷具有預防腫瘤、抗氧化、參與受損傷細胞修復和再生、腫瘤生物學逆轉等作用。

薯蕷皂苷元抗腫瘤的主要途徑是通過對多種細胞內信號通道、腫瘤特異性因子以及一些與腫瘤生長、分化、凋亡和變異相關的分子進行調控，從而對腫瘤的發生發展進行控制［11］。Moalic等［12］的研究發現薯蕷皂苷元在人類骨肉瘤pression 1547細胞中有抑制COX-2的活性和蛋白表達的作用。Raju等［13］研究發現，薯蕷皂苷元也可以通過干擾細胞HMG-CoA還原酶的膽固醇生物合成途徑，誘導HCT-116細胞的凋亡，并且存在劑量依賴性。薯蕷皂苷對正常乳腺上皮細胞沒有明顯的毒性，所以其對腫瘤細胞的毒性可能是特異性的［7］。薯蕷皂苷元在體內和體外均能誘導人結腸癌HT-29及畸變隱窩灶細胞凋亡，可能是通過抑制bcl-2及誘導caspase-3蛋白的表達實現的［14］。

本研究中，我們使用薯蕷皂苷元同時處理了胃癌BGC-823細胞及HUVEC，細胞活性檢測數據表明，相同濃度的薯蕷皂苷對內皮細胞增殖活性具有明顯的抑制作用，而對BGC-823細胞的增殖活性基本無影響。裸鼠體內移植腫瘤抑制實驗表明，薯蕷皂苷元能夠明顯抑制移植瘤的生長，這與體外實驗的結果明顯不同。因此，我們認為薯蕷皂苷元對BGC-823的增殖不產生直接影響，其對體內腫瘤增殖的抑制作用，應該是通過抑制腫瘤內血管的生成，從而影響腫瘤的血供實現的。在本研究中，我們還進行了細胞遷移檢測，結果發現薯蕷皂苷能明顯抑制BGC-823細胞的遷移能力。體外實驗結果表明，薯蕷皂苷抑制胃癌細胞遷移能力與其抑制細胞增殖活性之間是沒有相關性的。

綜上所述，薯蕷皂苷元具有較好的抗腫瘤作用，其對胃癌生長的抑制機制不是單純的通過對腫瘤細胞的殺傷作用而實現的，可能是多途徑的。因此我們認為薯蕷皂苷元作為化療的輔助用藥可增加化療藥的治療效果，符合未來中藥的發展方向。鑒于其對胃癌細胞本身并無明顯抑制作用，因此可減少對癌旁組織和細胞的損傷。盡管它與抗腫瘤有關的途徑不斷被發現，但其通過抑制血管生成而影響體內腫瘤生長途徑對我們后續的研究仍然具有積極的意義，如在篩選腫瘤抑制藥物時，不能將細胞活性作為唯一的參考標準，而對抗血管生成藥物的研究，則可以為胃癌臨床治療中，盡可能減少對癌旁組織的損傷提供了新的思路。

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M echanism underlying inhibition ofm igration of gastric carcinoma by diosgenin in vitro and vivo

HUO Zhong-hua，HU Jun，CHU Zhu-ling，LV Sheng，YIN Peng，ZHANG Li
（Department of General Surgery，the 454th Hospital of PLA，Nanjing Jiangsu 210002，China）

Objective：To investigate the principal pathway and preliminarymechanism by which diosgenin inhibits gastric carcinoma in vivo by treatment of human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）and gastric carcinoma（BGC-823）cells for comparison．M ethods：HUVEC and BGC-823 cells were treated with diosgenin at different concentrations and cell growth curveswere plotted to observe the effects of diosgenin on proliferative activities of endothelial cells and gastric carcinoma cells；the scraping linemethod and canalization in vitro were used to detect the effects of diosgenin treatment on canalization of endothelial cells and migration ability of gastric carcinoma cells by treating HUVEC and BGC-823 cells with diosgenin at a certain concentration；a subcutaneous tumormodel was established by inoculating nudemice with BGC-823 cells and diosgenin was administrated continuously to analyze its inhibitory effects on subcutaneous tumors．Results：Diosgenin had a significant effect on proliferation of endothelial cells in a concentration-dependent way，with a significant difference between the treatment groups and the control group at 48 or 72 h（P＜0．05）；and the same treatment had no evident effect on the proliferative activity of BGC-823 cells and effectively inhibited themigration of BGC-823 cells and significantly reduced the canalization of HUVEC cells in vitro；diosgenin exhibited a good inhibitory effect on subcutaneous tumors in the nudemicemodel of BGC-823 cells at an inhibitory rate of38．2%（P＜0．05）in comparison with themodel group．Conclusion：Diosgenin can eventually inhibit the proliferation of the subcutaneous tumormodel by suppressing endothelial cell activity and consequently suppressing blood supply．

book=395,ebook=32

diosgenin；human umbilical vein endothelial cells；BGC-823 cell；viability；capillary like tube formation；cellularmigration；nudemouse transplantation tumor

R979．19

A

1671－7783（2014）05－0394－05

10．13312／j．issn．1671-7783．y140213

霍中華（1970—），男，安徽太和人，主任醫師，博士，主要從事消化道腫瘤的診治研究。

2014－07－29 ［編輯］陳海林