RP—HPLC測定人尿液中甲磺酸帕珠沙星的濃度

徐文泉　趙勤　何思潤　董奇星　秦群

[摘要] 目的 建立測定甲磺酸帕珠沙星的尿藥濃度的方法，計算累積尿藥排泄率。 方法 采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，色譜柱為C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫35℃；流動相：乙腈-甲醇-水（6∶12∶82，含0.01%磷酸和0.01%三乙胺）；流速：1.10 ml/min；檢測波長：245 nm。 結(jié)果 甲磺酸帕珠沙星最低定量濃度為13.6 μg/ml；尿藥標準曲線線性范圍為13.6～2720 μg/ml（r=0.9997），方法回收率>90%；日內(nèi)、日間精密度（RSD）<10.0%。30名健康志愿者進行單劑量靜脈注射低、中、高三種劑量的注射用甲磺酸帕珠沙星后，帕珠沙星在24 h內(nèi)尿液中的累積尿藥排泄率分別為（92.63±5.04）%、（91.21±2.09）%、（90.22±3.53）%。 結(jié)論 該方法快速﹑簡便﹑準確度高，專屬性好，無雜質(zhì)干擾，適用于帕珠沙星體內(nèi)藥物濃度的測定及藥代動力學(xué)研究。

[關(guān)鍵詞] 甲磺酸帕珠沙星；反相高效液相色譜法；尿藥濃度

[中圖分類號] R96 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）03（b）-0009-03

甲磺酸帕珠沙星是由日本富山公司開發(fā)的新一代喹諾酮類抗生素[1]。它通過抑制DNA促旋酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ來發(fā)揮抗菌作用。體內(nèi)抗菌研究表明，本品抗菌譜與環(huán)丙沙星，亞胺培南相同，比頭孢他定和慶大霉素廣，革蘭氏陽性、革蘭氏陰性及厭氧菌對帕珠沙星十分敏感[2-4]。目前，國外已有對甲磺酸帕珠沙星的體內(nèi)藥代動力學(xué)的研究[5-6]，但較少。國內(nèi)也有甲磺酸帕珠沙星藥代動力學(xué)的研究[7-11]，且通過高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定血藥濃度的研究較多[7-15]，而通過測定尿藥濃度計算累積尿藥排泄率的研究較少[7-8，16]，為此本研究建立了反相高效液相色譜（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法測定尿液中甲磺酸帕珠沙星的濃度的方法，研究30名健康志愿者的尿藥濃度及其累積尿藥排泄率，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

甲磺酸帕珠沙星注射液（規(guī)格：300 mg/瓶，批號：040430，含量為標示量的98.8%，清華紫光古漢生物藥品有限公司）；甲磺酸帕珠沙星注射液對照品（清華紫光古漢生物藥品有限公司）；左氧氟沙星（內(nèi)標物，中國藥品生物制品檢定所）；甲醇（批號20040906，色譜純，湖南化工研究院精細化工研究院）；乙腈（批號52334，CALEDON公司）。

1.2 儀器

美國Agilent 1100 HPLC-UV配備G1313A自動進樣器和G1315B二極管陣列紫外檢測器。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫：35℃；流動相：乙腈-甲醇-水（6∶12∶82，含0.01%磷酸和0.01%三乙胺）；流速1.10 ml/min；檢測波長為：245 nm；進樣量：10 μl。

2.2 對照品溶液及內(nèi)標溶液的配制

精密稱取甲磺酸帕珠沙星對照品適量，分別用甲醇定容為6.8 mg/ml的儲備液，4℃儲存，使用時稀釋至所需濃度。

精密稱取左氧氟沙星適量，用甲醇配制成3 mg/ml的內(nèi)標溶液，4℃冷藏，臨用時稀釋至適宜濃度。

2.3 含藥尿液樣品的處理

吸取尿樣于1.5 ml塑料離心管中，高速離心5 min，吸取50 μl尿樣于1.5 ml試管中，加內(nèi)標（3 mg/ml左氧氟沙星甲醇液）15 μl，加入450 μl流動相，漩渦振蕩2 min，取上清液10 μl進樣分析。

2.4 專屬性考察

在上述色譜條件下，按上述方法操作，比較空白尿液、內(nèi)標左氧氟沙星加甲磺酸帕珠沙星標準品、空白尿樣加內(nèi)標左氧氟沙星加甲磺酸帕珠沙星對照品以及志愿者尿樣的樣本色譜圖，考察方法的轉(zhuǎn)一性，結(jié)果如圖1。

2.5 標準曲線和最低定量濃度

準確吸取空白尿樣50 μl于試管中加入內(nèi)標左氧氟沙星（3 mg/ml）15 μl，及帕珠沙星對照品溶液，配成含帕珠沙星為13.6、27.2、54.4、136、272、544、1360、2720 μg/ml的一系列濃度，按樣品處理項下操作。以濃度C對峰面積比值進行線形回歸，用最小二乘法計算得甲磺酸帕珠沙星回歸方程為：A=5.046C+0.008（r=0.9997）。本方法甲磺酸帕珠沙星最低定量濃度為13.6 μg/ml。

2.6 精密度及回收率試驗

空白尿液分別加入帕珠沙星標準品溶液適量，使成含帕珠沙星分別為13.6、136、2720 μg/ml低﹑中﹑高3個濃度的尿樣，按樣品處理項下操作，各濃度日內(nèi)重復(fù)5次，連續(xù)測定5 d，計算方法回收率及日內(nèi)、日間精密度（表1）。

2.7 準確度

準確吸取空白尿樣50 μl于試管中加入內(nèi)標左氧氟沙星（3 mg/ml）15 μl及帕珠沙星對照品溶液，使成含帕珠沙星分別為13.6、136、2720 μg/ml低﹑中﹑高3個濃度的尿樣，按樣品處理項下操作。連續(xù)制備并測定5 d，每個濃度進行5個樣本的分析，測得濃度與真實濃度相比，計算準確度（表2）。

2.8 樣品穩(wěn)定性

將含藥尿液樣品置-40℃冰箱冷凍保存，30天后測定含量，濃度分別為13.6、136、2720 μg/ml的低、中、高三種濃度的樣品含量下降變化均在3%以內(nèi)（分別為原濃度的98.12%、99.32%、98.56%），說明帕珠沙星的尿樣在-40℃至少30 d內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.9 累積尿藥排泄率

對試驗期間所收集的30名健康者的尿液測定后，按公式Fc=Xu/Xo×100%（其中Xu為0～24 h的累積排藥量，Xo為給藥劑量，低、中、高3組給藥劑量分別為150、300、600 mg）分別計算低、中、高3種劑量24 h累積排泄率，分別得到低、中、高3組24 h甲磺酸帕珠沙星的累積尿藥排泄率分別為（92.63±5.04）%、（91.21±2.09）%、（90.22±3.53）%。

3 討論

本實驗采取將尿樣稀釋后直接進樣的方法，尿樣中的雜質(zhì)可能會有干擾，且解凍后，部分尿樣中有沉淀，為了防止沉淀堵塞色譜柱，在稀釋前將尿樣高速離心5 min，將上面澄清溶液轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中供用。在測定尿樣過程中，部分尿樣有雜質(zhì)干擾，通過減慢流速到1.10 ml/min，雜質(zhì)峰和帕珠沙星峰完全分離，不影響測定。

在選定的色譜條件下，空白尿樣無內(nèi)源性雜質(zhì)干擾。帕珠沙星及左氧氟沙星的色譜峰形良好，雜質(zhì)峰無干擾。保留時間分別為5.24 min（帕珠沙星），6.71 min（左氧氟沙星），本法具有較高專屬性。

由本文研究得低、中、高3組濃度的帕珠沙星累積尿藥排泄率與國內(nèi)的研究報道一致，因此帕珠沙星主要經(jīng)腎臟由尿液排除，并且在體內(nèi)無蓄積。

HPLC-UV法測定帕珠沙星的尿樣濃度，方法快速﹑簡便﹑分離度好，無雜質(zhì)干擾。

[參考文獻]

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[16] 蔣心惠，范琦，鄧晴源，等.RP-HPLC測定人尿液中的甲磺酸帕珠沙星[J].華西藥學(xué)雜志，2006，21（4）：375-376.

（收稿日期：2014-02-12 本文編輯：郭靜娟）

2.9 累積尿藥排泄率

對試驗期間所收集的30名健康者的尿液測定后，按公式Fc=Xu/Xo×100%（其中Xu為0～24 h的累積排藥量，Xo為給藥劑量，低、中、高3組給藥劑量分別為150、300、600 mg）分別計算低、中、高3種劑量24 h累積排泄率，分別得到低、中、高3組24 h甲磺酸帕珠沙星的累積尿藥排泄率分別為（92.63±5.04）%、（91.21±2.09）%、（90.22±3.53）%。

3 討論

本實驗采取將尿樣稀釋后直接進樣的方法，尿樣中的雜質(zhì)可能會有干擾，且解凍后，部分尿樣中有沉淀，為了防止沉淀堵塞色譜柱，在稀釋前將尿樣高速離心5 min，將上面澄清溶液轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中供用。在測定尿樣過程中，部分尿樣有雜質(zhì)干擾，通過減慢流速到1.10 ml/min，雜質(zhì)峰和帕珠沙星峰完全分離，不影響測定。

在選定的色譜條件下，空白尿樣無內(nèi)源性雜質(zhì)干擾。帕珠沙星及左氧氟沙星的色譜峰形良好，雜質(zhì)峰無干擾。保留時間分別為5.24 min（帕珠沙星），6.71 min（左氧氟沙星），本法具有較高專屬性。

由本文研究得低、中、高3組濃度的帕珠沙星累積尿藥排泄率與國內(nèi)的研究報道一致，因此帕珠沙星主要經(jīng)腎臟由尿液排除，并且在體內(nèi)無蓄積。

HPLC-UV法測定帕珠沙星的尿樣濃度，方法快速﹑簡便﹑分離度好，無雜質(zhì)干擾。

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（收稿日期：2014-02-12 本文編輯：郭靜娟）

2.9 累積尿藥排泄率

對試驗期間所收集的30名健康者的尿液測定后，按公式Fc=Xu/Xo×100%（其中Xu為0～24 h的累積排藥量，Xo為給藥劑量，低、中、高3組給藥劑量分別為150、300、600 mg）分別計算低、中、高3種劑量24 h累積排泄率，分別得到低、中、高3組24 h甲磺酸帕珠沙星的累積尿藥排泄率分別為（92.63±5.04）%、（91.21±2.09）%、（90.22±3.53）%。

3 討論

本實驗采取將尿樣稀釋后直接進樣的方法，尿樣中的雜質(zhì)可能會有干擾，且解凍后，部分尿樣中有沉淀，為了防止沉淀堵塞色譜柱，在稀釋前將尿樣高速離心5 min，將上面澄清溶液轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中供用。在測定尿樣過程中，部分尿樣有雜質(zhì)干擾，通過減慢流速到1.10 ml/min，雜質(zhì)峰和帕珠沙星峰完全分離，不影響測定。

在選定的色譜條件下，空白尿樣無內(nèi)源性雜質(zhì)干擾。帕珠沙星及左氧氟沙星的色譜峰形良好，雜質(zhì)峰無干擾。保留時間分別為5.24 min（帕珠沙星），6.71 min（左氧氟沙星），本法具有較高專屬性。

由本文研究得低、中、高3組濃度的帕珠沙星累積尿藥排泄率與國內(nèi)的研究報道一致，因此帕珠沙星主要經(jīng)腎臟由尿液排除，并且在體內(nèi)無蓄積。

HPLC-UV法測定帕珠沙星的尿樣濃度，方法快速﹑簡便﹑分離度好，無雜質(zhì)干擾。

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（收稿日期：2014-02-12 本文編輯：郭靜娟）