RNA干擾致FRAT1基因沉默結(jié)腸癌HT29細胞模型的建立

于慶功++++++谷偉++++++王蘇雅++++++張欣欣++++++楊子榮++++++李文哲

[摘要] 目的 利用shRNA表達載體建立FRAT1基因沉默結(jié)腸癌HT29細胞模型。方法 將化學(xué)方法合成的特異性FRAT1基因siRNA，以人類結(jié)腸癌HT29細胞為實驗對象，采用Lipofectamine將FRAT1基因的shRNA表達載體導(dǎo)入細胞后，用RT-PCR和Western blot檢測目標基因FRAT1的表達水平。結(jié)果 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FRAT1 shRNA表達載體（pSINsi-FRAT1）后，F(xiàn)RAT1基因在mRNA和蛋白質(zhì)表達水平分別下降92.63%、55.72%（P<0.05）。結(jié)論 成功地建立了FRAT1基因沉默HT29細胞模型，為研究FRAT1生物學(xué)功能打下堅實的實驗基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] FRAT1；結(jié)腸癌；轉(zhuǎn)染；RNA干擾

[中圖分類號] R735.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）03（b）-0012-05

人FRAT1（frequently rearranged in advanced T cell lymphomas-1）基因最初被認為是T細胞淋巴瘤的原癌基因，是FRAT（frequetly rearranged in advanced T cell lymphomas）家族中的一員[1-2]，研究表明FRAT1基因過表達在腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用，并已證實人結(jié)腸癌細胞存在FRAT1基因的高表達[3]。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是目前應(yīng)用在逆向遺傳學(xué)（reverse genetics）研究中高效的基因沉默技術(shù)，在功能基因組學(xué)和基因治療的研究中得到廣泛應(yīng)用。RNAi技術(shù)可以關(guān)閉變異基因的表達，尤其是shRNA的應(yīng)用，可對基因表達產(chǎn)生穩(wěn)定強大的干擾效應(yīng)，為腫瘤治療提供了良好前景[4-5]。已有研究證明，利用RNAi技術(shù)特異性下調(diào)腫瘤細胞內(nèi)高表達的癌基因或者抗凋亡基因，可使癌細胞對化療和放療的敏感性增加，抑制癌細胞的增殖，促進癌細胞凋亡，從而提高抗腫瘤效應(yīng)[6-7]。本實驗選擇結(jié)腸癌HT29細胞株作為實驗對象，通過轉(zhuǎn)染化學(xué)合成的FRAT1 shRNA表達載體，建立長期穩(wěn)定表達FRAT1shRNA的實驗細胞模型，以期為研究FRAT1基因在結(jié)腸癌發(fā)病過程中的作用機制及基因治療打下堅實的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與細胞培養(yǎng)

1.1.1 實驗試劑 載體pSINsi-hu6購于大連寶生物公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamamine（11668-脂質(zhì)體2000）購于Invitrogen公司；篩選試劑G418（11811-023）購于美國Gibco公司；cDNA合成試劑盒，PCR試劑盒（上海生物工程公司）；引物（ULTRA PAGE）由上海生工生物工程股份有限公司合成；人結(jié)腸癌細胞株HT29（KG015）于南京凱基生物購買；DMEM培養(yǎng)基干粉（12100046-DMEM高糖-Y）為Gibco產(chǎn)品；胎牛血清（TBD21HB）購自天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；FRAT1兔抗人多克隆抗體（sc-130756）購自Santa cruz 生物公司；HRP標記山羊抗兔二抗（AB10058-Peroxidase-conjugated AffiniPure）購自碧云天生物技術(shù)研究所；ECL試劑盒從GE 醫(yī)療集團購買。

1.1.2 細胞培養(yǎng) HT29細胞株（購自南京凱基細胞庫）為本實驗室保存，細胞復(fù)蘇后用不含抗生素的培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS）培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計和合成siRNA及表達shRNA的DNA模板鏈 FRAT1基因siRNA序列 CTF182-1-1（序列GCAGTTACGTGCAAAGCTT）；其陰性對照序列為CTF182-N-1（序列TCTTAATCGCGTATAAGGC）。序列GCAGTTACGTGCAAAGCTT用于設(shè)計和合成針對FRAT1基因的shRNA。表達FRAT1 shRNA的DNA模板包括兩條鏈siRNA-sense：5′-GATCCAGCAGTTACGTGCAAAGCTTCTGTGAAGCCACAGATGGGAAG CTTTGCACGTAACTGCTTTTTTTAT-3′；siRNA-antisense：5′-CGATAAAAAAAGCAGTTACGTGCAAAGCTT CCCATCTGTGGCTTCACAGAAGCTTTGCACGTAACT GCTG-3′，其中Sense中的斜體部分為BamH Ⅰ酶切位點，Antisense中斜體部分為Cla Ⅰ酶切位點。下劃線部分為干擾序列及其配對序列，曲線部分為loop環(huán)形成序列。雙鏈FRAT1siRNA和無功能siRNA均由大連寶生物公司合成。

1.2.2 構(gòu)建重組FRAT1基因shRNA表達載體 提取pSINsi-hu6載體DNA，用BamH Ⅰ和Cla Ⅰ作雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后回收備用。使用TE將兩條DNA模板鏈溶解混勻后，根據(jù)以下條件退火形成雙鏈：94℃ 5 min，緩慢降到30℃ 90 min，4℃保存。然后經(jīng)T4 DNA ligase作用連入載體相應(yīng)的克隆位點，連接載體pSINsi-hu6-FRAT1轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5，在瓊脂平板挑取菌落進行增菌培養(yǎng)，取1 μl菌液作PCR，陽性者作DNA測序確定連接是否正確。

1.2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSINsi-hu6-FRAT1表達載體 轉(zhuǎn)染前一天細胞更換新鮮培養(yǎng)基，次日在6孔板上按每孔500 μl（含細胞5×105個）接種細胞3孔，其中第1孔為未轉(zhuǎn)染對照孔，第2孔為轉(zhuǎn)染無功能siRNA對照孔，第3孔為轉(zhuǎn)染pSINsi-hu6載體對照孔，第4孔為轉(zhuǎn)染pSINsi-hu6-FRAT1表達載體。每孔細胞轉(zhuǎn)染所需雙鏈shRNA和Lipofectamine 2000分別是1 μl，0.8 μg。按Lipofectamine 2000使用說明進行細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后每孔細胞分成3孔，分別加入G418（600 μg/ml）；以后每3天更換培養(yǎng)基和G418。等未轉(zhuǎn)染對照孔細胞都被殺死后，終止G418篩選，用含10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)具有G418抗性細胞，增殖到一定數(shù)量后，將其轉(zhuǎn)到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，定期用G418清除遺失抗性的細胞。另外同時篩選轉(zhuǎn)染表達無功能shRNA質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染pSINsi-hu6載體的HT29細胞作為陰性對照。

1.2.4 HT29細胞總RNA 抽提及RT-PCR 總RNA抽提按Trizol產(chǎn)品說明書進行。操作步驟如下：用PBS清洗兩遍收集的細胞，RNA Trizol裂解，氯仿抽提，異丙醇、75%乙醇沉淀、洗滌后，溶解于DEPC水中，測定RNA濃度。利用提取的RNA進行RT-PCR，獲得cDNA。RT-PCR按寶生物工程公司的試劑盒說明操作。RT條件為：42℃ 90 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。

1.2.5 PCR 取cDNA作為模板擴增FRAT1和GAPDH，其中擴增FRAT1特異性引物為：sense primer：5′-GCCCTGTCTAAAGTGTATTTTCAG-3′，antisense primer：5′-CTCTGCAGTCCTACTCAAGCG-3′。擴增片段長325 bp。擴增GAPDH作為內(nèi)參對照，引物序列分別是sense primer：5′-TCACCATCTTCCA GGAGCGAG-3′，antisense primer：5′-TGCTCAGTGTAGCCCAGGAT-3′。擴增產(chǎn)物長615 bp。PCR條件為：94℃ 3 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 25 s，72℃ 7 min，4℃ 5 min，30個循環(huán)。相關(guān)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。

1.2.6 轉(zhuǎn)染細胞總蛋白的提取及Western blot鑒定 收集細胞后用預(yù)冷PBS清洗兩遍，加入含PMSF的裂解液（1 ml含1 μl PMSF）200 μl，于冰上裂15 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清。蛋白濃度用BCA法測定，取上清12 μl，與3 μl 5×loading buffer混勻，100℃煮沸5 min，所得樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳120 V 25 mA 150 min分離后，冰上電轉(zhuǎn)至PVDF膜50 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，按順序加入兔抗人FRAT1基因抗體（4℃過夜，次日TBS-T Buffer洗6次，5 min/次），H暗室曝光，顯影，定影。底片在UVP凝膠成像系統(tǒng)下成像、保存。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將PCR及蛋白印跡操作最后得到的膠片進行拍照掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)（Gel-Pro Analyzer）進行分析。分別計算FRAT1各條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的相對光密度比值。重復(fù)3次實驗。HT29細胞中FRAT1基因的含量設(shè)為1，轉(zhuǎn)染pSINsi-hu6-FRAT1表達載體的細胞FRAT1基因下降率求3次平均值，得出FRAT基因表達的下降率。選用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0，采用兩組獨立樣本的t檢驗分別分析3組轉(zhuǎn)染組細胞中蛋白和mRNA的光密度與內(nèi)參GAPDH光密度比值與空白對照組蛋白和mRNA與內(nèi)參光密度比值，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 重組shRNA表達載體的鑒定

提取重組shRNA表達載體DNA進行測序鑒定，結(jié)果表明表達shRNA的DNA模板鏈已成功插入載體的正確位置（委托大連寶生物進行測序）。針對FRAT1基因的重組shRNA載體命名為pSINsi-hu6-FRAT1，而無功能shRNA載體命名為pSINsi-hu6-control（圖1）。

圖1 重組質(zhì)粒電泳

A.CTF182-1-1；B.CTF182-N-1；C.CTF182pSINsi-hu6

2.2 陽性克隆的篩選

利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染載體24 h后，對未轉(zhuǎn)染對照孔，轉(zhuǎn)染無功能shRNA對照孔，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pSINsi-hu6對照孔及轉(zhuǎn)染pSINsi-hu6-FRAT1表達載體孔進行G418篩選。經(jīng)G418（600 μg/ml）篩選培養(yǎng)，第2天細胞開始死亡，到了第5天未轉(zhuǎn)染對照孔細胞全部死亡。HT29細胞轉(zhuǎn)染無功能shRNA、轉(zhuǎn)染pSINsi-hu6載體及轉(zhuǎn)染pSINsi-hu6-FRAT1表達載體的細胞10～14 d后，出現(xiàn)G418抗性克隆，然后降低G418濃度（300 μg/ml）繼續(xù)培養(yǎng)2個月，細胞保持穩(wěn)定增殖直至出現(xiàn)明顯克隆形成。挑取單克隆從96孔-24孔-6孔-克氏瓶擴大培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染pSINsi-hu6-FRAT1篩選過程（圖2）。實驗結(jié)果證實成功篩選出攜帶重組FRAT1shRNA表達載體的HT29細胞系。

圖2 pSINsi-hu6-FRAT1細胞的篩選（×100）

A.篩選第1天；B.篩選第5天；C.篩選第14天；D.篩選后的單克隆

2.3 FRAT1基因沉默效果

為了檢測FRAT1基因沉默效果，先從未轉(zhuǎn)染細胞、轉(zhuǎn)染無功能siRNA的細胞、轉(zhuǎn)染pSINsi-hu6-FRAT1表達載體的細胞及轉(zhuǎn)染pSINsi-hu6載體的細胞進行RNA提取，并進行質(zhì)量鑒定。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，RNA沒有被降解（圖3）。利用提取的細胞總RNA，進行RT獲得cDNA，再以FRAT1 特異性引物PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，發(fā)現(xiàn)擴增出大小約325 bp的目的基因片段（圖4）。與轉(zhuǎn)染pSINsi-hu6-control的細胞相比，轉(zhuǎn)染pSINsi-hu6-FRAT1的HT29細胞FRAT1的表達明顯下降，證明FRAT1 shRNA成功轉(zhuǎn)染至HT29細胞中，且有良好的基因沉默效果，在FRAT1 mRNA水平與未轉(zhuǎn)染細胞組相比，下降了92.63%（P<0.05），而轉(zhuǎn)染無功能siRNA的細胞及轉(zhuǎn)染pSINsi-hu6載體的細胞組與未轉(zhuǎn)染細胞組相比mRNA水平?jīng)]明顯變化（P值分別為0.1172、0.1064）。

圖3 FRAT1RNA在四組細胞中的提取

A.normal colon cell；B.CTF182-1-1；C.CTF182-N-1；D.CTF182pSINsi-hu6

圖4 FRAT1mRNA在四組細胞中的表達

A.normal colon cell；B.CTF182-1-1；C.CTF182-N-1；D.CTF182pSINsi-hu6

為了進一步檢測FRAT1基因沉默效果，從未轉(zhuǎn)染細胞、轉(zhuǎn)染無功能siRNA的細胞、轉(zhuǎn)染pSINsi-hu6-FRAT1表達載體的細胞及轉(zhuǎn)染pSINsi-hu6載體的細胞中提取細胞裂解液。蛋白定量后，進行Western blot檢測，結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染細胞組相比，轉(zhuǎn)染pSINsi-hu6-FRAT1表達載體的細胞的FRAT1 蛋白表達量下降了55.72%（P<0.05），轉(zhuǎn)染無功能siRNA的細胞及轉(zhuǎn)染pSINsi-hu6載體的細胞組與未轉(zhuǎn)染細胞組相比，F(xiàn)RAT1蛋白含量沒明顯變化（P值分別為0.4340、0.1824）（圖5）。

圖5 FRAT1蛋白在四組細胞中的表達

A.normal colon cell；B.CTF182-1-1；C.CTF182-N-1；D.CTF182pSINsi-hu6

3 討論

結(jié)腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率成逐年增高趨勢，且病死率位居惡性腫瘤的第二位，進展后的結(jié)腸癌預(yù)后差是病死率高的主要原因[8]。當前，結(jié)腸癌治愈的主要手段是以手術(shù)為主的治療方法。然而，手術(shù)費用高且副作用大，其中局部復(fù)發(fā)和遠處的肝轉(zhuǎn)移是手術(shù)失敗的主要原因。因此，預(yù)防局部復(fù)發(fā)和肝轉(zhuǎn)移的早期診斷及時治療，對高危人群的篩選和預(yù)測復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，對提高患者的生活質(zhì)量和生存率具有極其重要的意義。FRAT1是FRAT家族中的一員，F(xiàn)RAT1通過與蛋白質(zhì)糖原合成酶激酶（GSK）3相結(jié)合，抑制GSK3對β-catenin的磷酸化，使胞質(zhì)內(nèi)游離的β-catenin 水平升高，β-catenin繼而進入胞核，激活c-myc，cyclinD1等一系列癌基因的表達，正向調(diào)節(jié)Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起細胞異常增殖，最終致使細胞發(fā)生癌變[9-10]。研究證實，F(xiàn)RAT1在食管癌、卵巢癌、星形細胞瘤、腦膠質(zhì)瘤、非小細胞肺癌、胃癌[11-16]中均有高表達，被認為是維持細胞惡性表型的關(guān)鍵因子。因此，F(xiàn)RAT1基因?qū)Y(jié)腸癌的基因治療具有重要意義。

RNAi為目前最有效的基因沉默技術(shù)，RNAi是由雙鏈RNA分子介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因靜默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）過程，為雙鏈RNA分子在mRNA水平上關(guān)閉相關(guān)基因表達的過程，是一項新興的基因阻斷技術(shù)[17]。RNAi能簡便、快捷和特異性地下調(diào)靶基因，用于基因功能的研究。相對于傳統(tǒng)的基敲除技術(shù)，RNAI技術(shù)具備投入少，周期短，操作簡單等特點。本實驗成功構(gòu)建的FRAT1shRNA表達載體pSINsi-hu6在細胞內(nèi)利用Ⅲ型RNA聚合酶（RNA polymerase Ⅲ），合成shRNA，exportin-5將其運輸?shù)桨|(zhì)，由Dicer識別，胞質(zhì)中裂解，產(chǎn)生siRNA，獲得持續(xù)基因沉默效應(yīng)。21個堿基序列的設(shè)計的合理性決定siRNA沉默效率，目前關(guān)鍵問題是如何設(shè)計針對目的基因的高效特異性siRNA。當今研究者們使用生物信息學(xué)、計算機輔助手段選擇最佳siRNA[18-19]。實驗中FRAT1基因在mRNA和蛋白質(zhì)表達水平分別下降92.63%、55.72%（P<0.05），成功建立了FRAT1基因表達下調(diào)的實驗細胞模型，可滿足進一步研究FRAT1基因功能的要求。

綜上所述，以pSINsi-hu6載體為介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染特異的FRAT1基因的siRNA，成功地構(gòu)建了FRAT1基因表達下調(diào)的實驗細胞模型，為FRAT1基因靶向治療的可行性作了初步探索，為進一步誘導(dǎo)其對化療藥物的敏感性以及動物體內(nèi)實驗提供了理論及實驗基礎(chǔ)，為人結(jié)腸癌的生物治療探索了一條新途徑。

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（收稿日期：2014-01-09 本文編輯：郭靜娟）

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（收稿日期：2014-01-09 本文編輯：郭靜娟）