一株雞源致病性大腸桿菌噬菌體的分離及其生物學特性

王禮偉， 梁 晏， 屈勇剛， 楊亞東， 李 飛， 楊一鳴， 施研進

(1.石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832003;2.新疆生產建設兵團農八師石河子總場北泉鎮獸醫站，新疆 石河子832011

目前，在雞業發展過程中，大腸桿菌病是一種較為常見高發病，常造成雞局部或全身性感染［1-2］。大腸桿菌病是一種條件致病菌，差的衛生條件、不良的衛生管理，很容易造成大腸桿菌病的發生。隨著養雞業規模化、集約化的不斷發展，大腸桿菌病越發嚴重，病原對抗生素和抗菌藥的耐藥性越來越強。為了防治雞大腸桿菌病，飼養主大多采用飼喂抗生素或抗菌藥物的方法，但普遍存在耐藥性和用藥成本升高等問題。同時，由于長期使用抗生素或抗菌藥，使產品存在藥物殘留，導致產品品質下降，很難滿足人們對綠色健康養殖的要求。

噬菌體是以細菌為寄主的一類非細胞微生物。自1917年人們發現噬菌體以來，利用噬菌體預防和治療細菌性疾病引起了人們的關注［3］。早在20世紀初噬菌體治療就已經取得過可喜的成果，國外第一次公開報道的噬菌體治療是在1921年，利用噬菌體制劑治療葡萄球菌皮膚感染［4］。現今，噬菌體的運用越來越廣泛。利用噬菌體治療具有一些先天性的優勢:自身的繁殖能力強、裂解細菌的特異性較強、無耐藥性、無殘留等。本研究擬從養殖場污水及糞便中分離雞大腸桿菌噬菌體，對其生物學特性進行分析。

1 材料與方法

1.1 菌株和污水

28株雞源致病性大腸桿菌(Eco1～Eco28)由石河子大學動物科技學院傳染病實驗室分離鑒定，凍干保存于－20℃。污水采自石河子周邊地區養雞場附近，共10份。

1.2 主要試劑

LB培養基按文獻［5］配制;普通營養瓊脂、麥康凱培養基均購于北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.3 宿主菌的準備

將28株雞源致病性大腸桿菌分別接種到裝有3 ml液體LB液體培養基的試管中，于37℃條件下，160 r/min振蕩培養8 h，備用。

1.4 噬菌體的富集與分離

將采集的污水用8層紗布過濾，再用2層濾紙過濾，取過濾后的污水2.5 L，加入固體 CaCl2使終濃度達到1 mmol/L，在10 000 r/min下離心10 min。過濾除菌，取液體1 L，加入30 ml液體LB培養基和28株新鮮培養的雞源致病性大腸桿菌懸液各1 ml，37℃振蕩培養24 h，在10 000 r/min下離心5 min，上清液用0.22μm的濾膜過濾除菌。取28支試管，每管分別加入新鮮培養的28株雞源致病性大腸桿菌懸液0.3 ml，再加入處理后的液體0.3 ml，振蕩使其充分混勻，室溫下靜置10～15 min，使噬菌體和宿主菌充分吸附。再加5 ml已溶化的50℃左右0.7%半固體LB培養基，再次振蕩混勻，然后均勻地鋪在1.8%的固體LB瓊脂上，待其凝固后，37℃倒置培養8～12 h，觀察噬菌斑的生長情況［6］。

1.5 噬菌體的純化

當有噬菌斑出現時，先取相應的宿主菌接種到5 ml液體LB培養基中，37℃、160 r/min振蕩培養8 h。然后用10 μl槍頭挑取單個噬菌斑接種到相應的宿主菌培養物中，37℃、160 r/min振蕩培養 8 h，擴增噬菌體。然后在10 000 r/min下離心5 min，過濾除菌，無菌取上清液。單個噬菌斑經此方法反復純化3～5次，即可得到較純的噬菌體。

1.6 噬菌體的保存

將分離純化后得到的噬菌體1 ml移入1.5 ml凍存管，每株噬菌體6管，置于－20℃冰箱中保存。

1.7 噬菌體生物學特性測定

1.7.1 噬菌體效價(滴度)測定 用LB液體培養基作為稀釋液，把純化后的噬菌體做連續10倍稀釋，分別取100μl加入0.2 ml相應宿主菌，振蕩使其充分混勻，室溫靜置15 min，使噬菌體充分吸附宿主菌。再加入5 ml已溶化的50℃左右的0.7%LB半固體培養基，再次振蕩混勻，采用雙層瓊脂平板法，觀察噬菌斑的生長情況［7］。上述每個稀釋度分別做3個平行重復。計數時，選取噬菌斑數為30～300的稀釋度平板，然后取適當稀釋度3個平行重復的平均數，以計算噬菌體的滴度。噬菌體的效價(PFU/ml)=稀釋倍數×平均噬菌斑數×100。

1.7.2 噬菌體裂解譜的測定 參照文獻［8］，采用單斑法進行測定:即取28株雞源致病性大腸桿菌的菌懸液分別均勻地涂在固體LB瓊脂平板上，然后分別取2μl純化后的噬菌體懸液，滴在平板不同的位置上，每板可滴4～6滴，懸液之間不能接觸，37℃培養8～12 h，觀察噬菌斑的生長情況。

1.7.3 噬菌體的最佳感染復數測定 感染復數(Multiplicity of infection，MOI)是指感染發生之前，噬菌體與宿主菌數量的比值。最佳感染復數為獲得子代噬菌體最高產量時的MOI。據文獻［9］，取分離株噬菌體對應的對數期菌懸液，按感染復數分別為 0.001、0.010、0.100、1.000加入噬菌體。37℃搖床振蕩培養8 h，采用雙層瓊脂平板法測定最佳感染復數。

1.7.4 噬菌體的pH穩定性測定 用鹽酸和氫氧化鈉調節配制 pH 為4、5、6、7、8、9的 LB 液體培養基。取不同 pH 值的液體LB培養基1 ml分別加入試管，高壓滅菌。將100μl噬菌體加入試管，在37℃條件下反應2 h。利用LB液體培養基進行稀釋，取100μl噬菌體處理液，加入0.2 ml相應宿主菌，振蕩使其充分混勻，室溫靜置15 min。采用雙層瓊脂平板法，測定不同pH值條件下噬菌體的效價。

1.7.5 噬菌體的溫度穩定性測定 調節水浴鍋的溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃。將分離株噬菌體放在水浴鍋靜置1 h。利用LB液體培養基進行稀釋，取100μl噬菌體處理液，加入0.2 ml相應宿主菌，振蕩使其充分混勻，室溫靜置15 min。采用雙層瓊脂平板法，測定不同溫度條件下噬菌體的效價。

1.7.6 噬菌體的紫外線穩定性測定 將1 ml噬菌體稀釋液(1.98×102PFU/ml)加入平板中，直接暴露在超凈工作臺中，紫外線照射燈功率為20 W，距離為40 cm。在0 min、2 min、4 min、6 min、8 min、10 min、12 min 時，取 100 μl噬菌體處理液加入0.2 ml相應宿主菌，振蕩使其充分混勻，室溫靜置15 min。采用雙層瓊脂平板法，測定不同照射時間條件下噬菌體的效價。

2 結果

2.1 大腸桿菌噬菌體的分離及噬菌斑的觀察

采用雙層瓊脂平板法，肉眼可見大小不一、邊緣整齊、無暈環、透明清晰的噬菌斑，在顯微鏡下測量其直徑為0.597 mm。最終分離純化出1株大腸桿菌噬菌體，將其命名為EcP10。

2.2 噬菌體EcP10效價(滴度)

通過雙層瓊脂平板法測定可知，噬菌體EcP10的效價為1.95 ×108PFU/ml。

2.3 噬菌體EcP10裂解譜

通過噬菌譜的測定，發現噬菌體EcP10可裂解28株雞源致病性大腸桿菌(Eco1～Eco28)中的12株(Eco2、Eco4、Eco5、Eco6、Eco10、Eco13、Eco15、Eco16、Eco20、Eco23、Eco25、Eco26)，其裂解率為42.86%。

2.4 噬菌體EcP10的最佳感染復數

經過8 h的培養，通過效價的測定，當MOI=1時，噬菌體EcP10產生子代的效價為 5.8×108PFU/ml，為在4種不同條件下最高的，說明EcP10的最佳感染復數為1。

2.5 噬菌體EcP10的p H值穩定性

噬菌體EcP10經過6種不同的pH條件(pH 4、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9)處理2 h 后，在 pH 值為6 的時候，噬菌體的效價最高，為 6.25×106PFU/ml。當pH為4時，效價下降到3.3×105PFU/ml;當pH為9時，效價下降到1.15×105PFU/ml。這種趨勢說明過酸、過堿都會造成噬菌體的裂解能力下降，明顯影響噬菌體EcP10的活性。

2.6 噬菌體EcP10的溫度穩定性

噬菌體EcP10經過4種不同溫度(30℃、40℃、50℃、60℃)條件處理1 h后，溫度為30℃時效價最高，達到6.75×105PFU/ml，同時，30 ～50 ℃ 時效價均維持在 105PFU/ml以上;60℃時，效價明顯下降。這種趨勢說明高溫也嚴重影響噬菌體的活性。

2.7 噬菌體EcP10的紫外線穩定性

隨著紫外線照射時間的持續，噬菌斑數目測定結果表明，噬菌體EcP10的活性逐漸降低。紫外線持續照射12 min時僅產生2個噬菌斑，紫外線的照射直接導致噬菌體快速失活。

2.8 噬菌體EcP10保存時間

分離株噬菌體EcP10在－20℃冰箱中保存1個月，噬菌體的效價為1.40×108PFU/ml，沒有發生明顯的變化。

3 討論

噬菌體是感染細菌的病毒，可分為裂解性噬菌體和溫和噬菌體。噬菌體對宿主細菌的裂解和感染是特異性的，是由受體決定的，很少產生耐藥性的問題，也不會造成機體的菌群失調，每種細菌都有自身敏感的噬菌體。利用這一特性，用噬菌體殺滅細菌，稱為噬菌體療法［9］。作為一種微生態制劑，噬菌體治療具有取材廣泛、繁殖能力強、裂解細菌相對特異性、無耐藥性、無殘留等優點。因此，噬菌體相關研究越來越受到人們的重視［10］。近年來，噬菌體微生態制劑，已經廣泛地應用于醫學、獸醫學、食品行業、養殖業、環境控制等相關領域［11］。

本試驗利用雞源致病性大腸桿菌作為宿主菌，從采自石河子周邊地區雞場附近的污水中分離純化出1株雞源致病性大腸桿菌噬菌體EcP10，同時對分離株噬菌體EcP10的生物學特性進行了系統分析。通過效價、噬菌譜、最佳感染復數、pH值穩定性、溫度穩定性、紫外線穩定性的測定，以及在－20℃條件下保存1個月的效價變化等多項指標的測定，證實該分離株噬菌體EcP10具有較高的效價、較廣的噬菌譜和較好的穩定性。本研究為后期研發噬菌體微生態制劑，開展噬菌體治療工作奠定了基礎。

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