滋腎清心湯對圍絕經期大鼠卵巢bcl-2和bax表達影響的實驗研究

雷雯 繆婷玉 陳赟 盧蘇

（1.南京中醫藥大學，江蘇南京 210023；2.江蘇省中醫院，江蘇南京 210029）

滋腎清心湯對圍絕經期大鼠卵巢bcl-2和bax表達影響的實驗研究

雷雯1繆婷玉1陳赟2盧蘇2

（1.南京中醫藥大學，江蘇南京 210023；2.江蘇省中醫院，江蘇南京 210029）

目的：研究中藥滋腎清心湯對圍絕經期大鼠卵巢bcl-2和bax蛋白表達的影響，探討滋腎清心湯治療圍絕經期綜合征可能的作用機制。方法：選用自然衰老的圍絕經期雌性大鼠，隨機分為4組（每組10只）：更年期大鼠模型組（模型組）和滋腎清心湯高、中、低劑量組，另選10只青年雌性大鼠作為青年對照組。連續灌胃處理4周后，采用蛋白印跡（Western blot）及RT-PCR檢測大鼠卵巢中Bcl-2和Bax蛋白及基因的表達。結果：與模型組相比，滋腎清心湯高劑量能顯著降低卵巢組織中Bax蛋白的表達，顯著上調Bcl-2/Bax的比值；滋腎清心湯各劑量均能明顯降低卵巢組織中Bax基因表達，明顯升高Bcl-2基因表達，從而顯著上調Bcl-2/Bax比值，延緩卵巢顆粒細胞的凋亡。結論：滋腎清心湯通過調節圍絕經期大鼠卵巢中凋亡相關基因bcl-2和bax蛋白及基因的表達，上調Bcl-2/Bax蛋白及基因的比值，從而延緩卵巢衰老，這可能是其治療圍絕經期綜合征的分子機制之一。

圍絕經期綜合征 滋腎清心湯 卵巢 細胞凋亡 bcl-2 bax 實驗研究

圍絕經期綜合征是指婦女在絕經前后因為卵巢功能衰退，性激素水平波動而引起的一系列身體及精神心理癥狀。目前西醫主要采用激素替代療法（HRT）治療[1]，該方法具有嚴格的適應證及禁忌證，大量臨床研究表明激素替代療法存在潛在的致癌危險及其他不良反應，多數患者難以接受。滋腎清心湯是在中醫藥理論的指導下，結合臨床工作經驗化裁而來，全方清心安神、滋腎養陰，臨床治療本病獲得較好的療效。本研究以卵巢細胞凋亡作為切入點，觀察滋腎清心湯對初老大鼠卵巢細胞凋亡相關基因Bcl-2、Bax表達的影響，探索滋腎清心湯在卵巢中可能的作用位點。

1 實驗材料

1.1 實驗動物SD大鼠，12～14月齡，40只，體重（350±20）g，經陰道脫落細胞涂片檢查，呈現出動情周期紊亂、動情間期延長，確定為圍絕經期鼠。4月齡大鼠10只，體重（200±20）g。大鼠均由浙江省動物實驗中心提供。飼養條件：二級實驗室，普通全價飼料喂養，自由攝水，室溫（24±2）℃，濕度45%～ 65%。大鼠適應性喂養1周后開始實驗。

1.2 主要試劑滋腎清心湯，組方：蓮子心5g，黃連3g，鉤藤15g，炒酸棗仁15g，浮小麥30g，丹參10g，干地黃10g，山茱萸9g。中藥由江蘇省中醫院提供，水煎并濃縮，相當于生藥3.2g/mL，4℃冰箱中保存備用。中藥劑量按人體重60kg，5倍系數計算。內參一抗（β-Actin）由Immunoway公司提供，二抗（羊抗小鼠IgG-HRP），二抗（羊抗兔IgG-HRP）由Jackson公司提供。cDNA第一鏈合成試劑盒和Taq DNA Polymerase由Thermo Fisher公司提供。Regular Agarose G10由Biowest公司提供。50×TAE電泳緩沖液由KeyGen公司提供。

2 實驗方法

2.1 分組與給藥將更年期大鼠隨機分為4組：更年期大鼠模型組（模型組）和清心滋腎方高、中、低劑量組。另取10 只4月齡大鼠作為青年對照組。清心滋腎方高、中、低劑量組分別灌服滋腎清心湯32g/（kg·d）、16g/（kg·d）、8g/（kg·d）。每日給大鼠灌胃1次，連續4周。模型組和青年對照組給予生理鹽水10mL/（kg·d）。每日給大鼠灌胃1次，連續4周。大鼠末次給藥24h后斷頭處死，快速取出雙側卵巢，經液氮速凍后于-70℃冰箱凍存，用于組織蛋白的檢測。

2.2 Western blot法檢測卵巢中Bcl-2及Bax蛋白的表達提取大鼠卵巢總蛋白，進行SDS-PAGE轉膜，用質量濃度為30g/L（0.03g/mL）的牛血清白蛋白（BSA）37℃封閉1h，再分別用Bcl-2、Bax和β-actin兔抗鼠多克隆抗體（1∶400）37℃孵育1h。TBST洗膜10min×3次，TBS洗膜10min。最后用ALP標記的山羊抗兔IgG（1∶500）37℃孵育1h。TBST洗膜10min×3次，TBS洗膜10min。NBT/BCIP顯色。以β-actin作為內參照。

2.3 RT-PCR方法檢測卵巢中Bcl-2、Bax的基因取卵巢組織進行RNA提取，提取后進行RNA濃度和純度的鑒定，經鑒定符合實驗要求后，進行cDNA第一鏈合成（20μL體系），然后進行PCR實驗。取滅過菌且無核酸酶的0.2mL離心管，在冰上依次加入如下組分：10×Taq Buffer 5μL；MgCl2（25mmol/L）4μL；dNTPs（10mmol/L）1μL；引物Ⅰ（10μmol/L）1μL；引物Ⅱ（10μmol/L）1μL；cDNA1μL；TaqDNA Polymerase 0.5μL；滅菌雙蒸水至總體積50μL。第一階段：95℃、5min預變性；第二階段：95℃、40s，56℃、40s，72℃、45s，32個循環，退火、變性、延伸；第三階段：72℃、10min最終延伸。引物序列及PCR產物大小見表1。

表1 引物序列及PCR產物大小

3 實驗結果

3.1 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2、Bax蛋白的表達治療后滋腎清心方各組均可升高圍絕經期大鼠卵巢中的Bcl-2蛋白，與青年對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；降低Bax蛋白，與青年對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；升高Bcl-2/Bax蛋白的比值，與青年對照組比較中、低劑量組具有顯著性差異（P＜0.01），高劑量組未見差異性（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2及Bax蛋白表達比較（±s）

表2 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2及Bax蛋白表達比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與青年對照組比較，▲▲P＜0.01。

組別動物數（只）Bax Bcl-2Bcl-2/Bax青年對照組100.4033±0.0581**1.0100±0.35232.3504±0.9792**模型組101.0333±0.1812▲▲0.5167±0.19060.4629±0.1980▲▲滋腎清心湯低劑量組100.9133±0.13170.5933±0.22820.6105±0.2620▲▲滋腎清心湯中劑量組100.7433±0.17850.7267±0.31870.9057±0.3589▲▲滋腎清心湯高劑量組100.5633±0.2255*0.8867±0.34971.5153±0.4794*

3.2 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2及Bax基因的表達見表3。

表3 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2及Bax基因表達比較（±s）

表3 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2及Bax基因表達比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與青年對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別動物數（只）bax bcl-2Bcl-2/Bax青年對照組100.9990±0.1590**0.9994±0.0031*1.0005±0.0170**模型組108.8051±0.78870.1526±0.02970.01712±0.0020滋腎清心湯低劑量組106.4810±0.6566**▲▲0.2803±0.0216*▲0.0436±0.0063*▲▲滋腎清心湯中劑量組104.7383±0.5839**▲▲0.4732±0.0164*▲0.1009±0.0131**▲▲滋腎清心湯高劑量組102.5693±0.3544**▲▲0.6444±0.0045*▲0.2543±0.0384**▲▲

4 討論

圍絕經期綜合征是婦女絕經前后出現性激素波動或減少所致的一系列身體及精神心理癥狀。現代醫學認為婦女進入圍絕經期后，卵巢功能衰退，分泌的雌激素減少，卵泡期延長，卵泡逐漸停止發育。由于雌激素分泌減少，對垂體的負反饋減弱，破壞了下丘腦—垂體—卵巢軸的平衡，產生下丘腦和垂體功能亢進的現象[2]。這些內分泌環境的變化導致腦內β-內啡肽和5-羥色胺水平異常，一氧化氮、內皮素的異常，CD3+、CD4+減少、CD8+增加等，從而出現精神情緒變化失調，交感神經系統、體溫調節中樞不穩定，血管舒縮平衡失調，免疫功能降低等一系列臨床癥狀。

目前研究認為是顆粒細胞的凋亡觸發卵泡閉鎖[3]。更年期婦女卵泡及顆粒細胞的急劇減少，產生的雌激素及促性腺激素受體減少，從而出現卵巢功能的減退。目前已經闡明的凋亡信號傳導途徑主要有兩條：一條是細胞表面死亡受體途徑，另一條是線粒體途徑，這兩條途徑最終都匯集為Caspases家族蛋白酶的級反應過程[4]。Bcl-2和Bax在線粒體應激誘導的細胞凋亡中起關鍵作用。Bcl-2及Bax同屬于Bcl-2基因家族，Bcl-2能抑制細胞凋亡，Bax能促進細胞凋亡，Bax與bcl-2形成異二聚體復合物，維持促凋亡基因在細胞內的定位分布，使細胞不進入凋亡程序[5]。但當Bax蛋白超表達時，Bax/Bax同源二聚體的數量明顯升高，細胞對死亡信號的反應性增強，啟動凋亡；當Bcl-2表達增高時，Bax/Bax二聚體解離，生成穩定的Bcl-2Bax異源二聚體，對抗Bax的誘導凋亡作用[6]。已有研究表明，一切促進或抑制細胞凋亡的作用，都可歸結成Bcl-2/Bax比值的變化[7]。

為更確切地了解滋腎清心湯治療圍絕經期綜合征的作用位點，我們對Bcl-2、Bax同時進行了基因和蛋白的檢測。結果表明，滋腎清心湯能夠促進圍絕經期大鼠卵巢組織中Bcl-2的表達，抑制卵巢顆粒細胞凋亡，并能抑制Bax誘導卵巢顆粒細胞凋亡的作用，從而延緩卵巢衰老，這可能是其治療圍絕經期綜合征的作用機制之一。

本實驗中采用RT-PCR與Westren blot檢測，對基因的調節作用較蛋白質顯著。其原因可能是，在細胞內，蛋白質是決定細胞基因表型及對外信息發生的反應性，蛋白質水平的表達不僅取決于基因轉錄的速率，也與mRNA的出核過程、細胞漿定位、轉錄物的穩定性、mRNA翻譯調節及蛋白質的降解密切相關，蛋白質的生物活性及功能主要通過翻譯后加工、磷酸化及蛋白酶的水解而發生[8]，基因轉錄的mRNA水平并不能完全可靠地代替其相應蛋白質的水平。

[1]Shuster LT，Rhodes DJ，Gostout BS，et al.Premature menopause or early menopause：long-term health consequences.Maturitas，2010，65（2）：161

[2]司徒儀.中西醫結合婦產科學.北京：科學出版社，2003：189

[3]秦佳佳.中成藥坤寧安調控圍絕經期大鼠卵巢顆粒細胞凋亡因子Bcl-2 mRNA表達的特點.中國臨床康復，2006，10（19）：149

[4]Riedl S J，Shi Y.Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis.Nature Reviews Molecular Cell Biology，2004，5 （11）：897

[5]Kawatani M，Imoto M.Deletion of the BH1 domain of Bcl-2 accelerates apoptosis by acting in a dominant negative fashion. Journal of Biological Chemistry，2003，278（22）：19732

[6]Tsukahara S，Yamamoto S，Shwe T T W，et al.Inhalation of low-level formaldehyde increases the Bcl-2/Baxexpression ratio in the hippocampus of immunologically sensitized mice. Neuroimmunomodulation，2006，13（2）：63

[7]SprickMR，WalczakH.TheinterplaybetweentheBcl-2 family and death receptor-mediated apoptosis.Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Molecular Cell Research，2004，1644 （2）：125

[8]Gygi S P，Rochon Y，Franza B R，et al.Correlation between protein and mRNA abundance in yeast.Molecular and cellular biology，1999，19（3）：1720

編輯：吳寧

R289.53文獻識別碼A

1672-397X（2014）09-0071-02

雷雯（1987-），女，碩士研究生，中醫婦科學專業。

盧蘇，lusu0926@sina.com

2014-03-20