黃芪甲苷對內皮祖細胞生物學功能影響的實驗研究

陳聲榮 呂作陪 甘艷艷

（洞頭縣人民醫院，浙江洞頭 325700）

黃芪甲苷對內皮祖細胞生物學功能影響的實驗研究

陳聲榮 呂作陪 甘艷艷

（洞頭縣人民醫院，浙江洞頭 325700）

目的：觀察黃芪甲苷對內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）生物學功能的影響。方法：采用密度梯度離心法獲取外周血單個核細胞培養內皮祖細胞，培養7d后，收集貼壁細胞并隨機分為對照組及黃芪干預組（黃芪甲苷濃度分別為5、25和75μg/mL），各自干預24h后采用細胞計數試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）、黏附能力測定試驗、Matrigel體外成血管試驗及Transwell小室法觀察黃芪甲苷對EPCs增殖、黏附、成血管及遷移能力的影響。結果：與對照組比較，黃芪甲苷各劑量干預組內皮祖細胞增殖能力、黏附細胞數、血管數、遷移細胞數均明顯增加。結論：黃芪甲苷可顯著提高內皮祖細胞多種細胞生物學功能。

內皮祖細胞 黃芪甲苷 體外實驗

內皮祖細胞因其獨特的促血管新生及內膜修復作用近幾年成為研究熱點[1-3]。通過不同方法提高內皮祖細胞各種生物學功能有助于其發揮促血管新生及內膜修復作用，從而有益于動脈粥樣硬化及缺血性血管疾病的防治。黃芪臨床上用于治療心腦血管疾病，但深入的機制研究尚待開展。本研究觀察黃芪有效成分黃芪甲苷對內皮祖細胞生物學功能的影響，探討黃芪治療缺血性心腦血管病的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料細胞計數試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）購自日本同仁化學研究所，基質凝膠matrigel購自美國Becton Dickson公司，Transwell小室購自美國Corning公司，胎牛血清、M199培養基、PBS液購自Gibco公司，人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物公司，黃芪甲苷購自上海融禾公司。

1.2 方法

1.2.1 內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）的培養

采用貼壁培養法培養內皮祖細胞[2]。取健康志愿者外周血20mL，密度梯度離心，將分離的單個核細胞接種于預包被纖維連接蛋白的六孔板中，每孔加入1mL M199培養基[含胎牛血清（10%）、VEGF（10ng/mL），bFGF（10ng/mL）]，置37℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養。3d后更換培養液并清洗未貼壁細胞，以后每隔3d換半液。

1.2.2 鑒定將終濃度為2.4μg/mL的DiI-ac-LDL加入預裝蓋玻片的6孔板中，與細胞避光孵育1～2h，吸棄培養液，4%多聚甲醛固定15min，PBS沖洗，加入FITC-UEA-I lectin（10mg/L），繼續避光孵育1h，取出蓋玻片，PBS輕洗，加抗卒滅劑后置熒光顯微鏡下拍片。

1.2.3 分組培養7d后，以0.25%胰酶將各孔細胞消化制成細胞懸液，以同等數量細胞接種，隨機分為對照組與黃芪甲苷各劑量組（黃芪甲苷濃度分別為5、25、75μg/mL），培養24h后，進行以下細胞生物學功能檢測。

1.2.4 增殖能力檢測用0.25%胰蛋白酶消化收集貼壁細胞，懸浮在500μL培養液中，計數，將等量EPC接種到包被纖維連接蛋白的96孔培養板，添加含10%CCK-8溶液的培養基，培養4h后，置酶標儀450nm處測OD值。

1.2.5 黏附能力檢測收集培養細胞，懸浮在500μL培養液中，計數，然后將同等數目的EPC接種在包被纖維連接蛋白的培養板上，在37℃培養30min，PBS洗棄未貼壁細胞，計數貼壁細胞。

1.2.6 成血管能力檢測4℃溶解Matrigel膠，取50μL/孔加入96孔板中（冰上操作），37℃孵育1h成膠待用。各組細胞按10000個/孔的細胞密度接種于鋪被有Matrigel凝膠的96孔板中，每組設6個復孔，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養約24h。取出96孔板，置于倒置顯微鏡下觀察、拍片，各組均隨機選取5個視野（×100）計數小管形成數量。

1.2.7 遷移能力檢測消化收集各組貼壁細胞，制成5×105/mL的單細胞懸液。于24孔板中放入transwell小室。下室加入600μL含10%FBS的培養基，上室加入100μL上述細胞懸液，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中孵育24h。取出transwell小室，D-Hank's液淋洗2次，用棉簽擦去微孔膜上層的細胞，4%多聚甲醛固定10min，0.25%結晶紫染色，各組均隨機選取5個視野（×400），計數EPCs的遷移數量。

1.2.8 統計學方法用SPSS16.0統計軟件進行統計分析，計量資料以（±s）表示，組間資料比較采用方差分析，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 EPCs的培養及鑒定培養細胞呈現典型的集落形態，單個六孔板中可見多個細胞集落（圖1-A）。雙熒光染色試驗顯示細胞攝取Dil-ac-LDL且結合FITC-UEA-1 lectin：融合圖像顯示胞膜結合lectin呈綠色熒光，而胞質的黃色熒光是吞噬ac-LDL后紅色熒光與胞膜綠色熒光融合而成（圖1-B）。

圖1 EPCs的培養及鑒定

2.2 黃芪甲苷對EPCs增殖黏附、成血管能力的影響見表1、圖2。與對照組比較，不同濃度黃芪甲苷干預24h后，呈濃度依賴性地提高EPCs的增殖黏附和成血管能力。

2.3 黃芪甲苷恢復EPCs受損的遷移能力與對照組比較，經過24h黃芪甲苷干預后，EPCs遷移能力呈濃度依賴性地提高。見圖3及表1。

表1 黃芪甲苷對內皮祖細胞生物學功能的影響（±s）

表1 黃芪甲苷對內皮祖細胞生物學功能的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01。

組組別別劑量增殖能力（OD值）劑量增殖能力（OD值）血管數（個/100倍視野）對照組粘附細胞數（個/200倍視野）0.42±0.06黏附細胞數（個/200倍視野）0.42±0.06遷移細胞數（個/200倍視野）52.4±9.3遷移細胞數（個/200倍視野）52.4±9.3血管數（個/100倍視野）對照組20.4±5.830.4±7.8 20.4±5.830.4±7.8黃芪甲苷低劑量組64.1±11.1*26.3±5.2*42.8±10.2*5μg/mL0.48±0.06*黃芪甲苷中劑量組25μg/mL0.55±0.07*68.2±11.0*37.1±6.8*49.2±10.1*黃芪甲苷高劑量組75μg/mL0.69±0.09*79.6±12.3*40.9±8.1*60.5±13.2*黃芪甲苷低劑量組64.1±11.1*26.3±5.2*42.8±10.2*5μg/mL0.48±0.06*黃芪甲苷中劑量組25μg/mL0.55±0.07*68.2±11.0*37.1±6.8*49.2±10.1*黃芪甲苷高劑量組75μg/mL0.69±0.09*79.6±12.3*40.9±8.1*60.5±13.2*

圖2 黃芪甲苷對EPCs成血管能力的影響

圖3 黃芪甲苷對EPCs遷移能力的影響

3 討論

自1997年Arasaha發現循環中存在能促進血管新生的的內皮祖細胞以來[1]，有關EPCs的研究不斷深入。EPCs具有血管新生及內膜修復兩大功效[2-3]，能響應局部損傷與缺血，定向歸巢修復血管促進血管新生。大量研究表明，EPCs是心血管疾病的一個生物標志物，循環中EPCs數量及功能與心血管危險相關，其數量及功能受損可導致血管內皮修復功能下降，血管新生能力減弱，并加速心血管事件的進程[4-6]。而通過不同方法提高循環EPCs數量及生物學功能將有助于心腦血管疾病的防治。因此EPCs正在成為缺血性心血管疾病的干預新靶點。

黃芪為臨床常用中藥，性溫，味甘，具有補氣固表、斂瘡生肌等功效。黃芪中的主要活性成分為黃芪多糖、黃芪皂苷及黃芪異黃酮，而黃芪皂苷中的黃芪甲苷有保護血管內皮、抗衰老、抗氧化等作用[7-8]。本實驗以不同濃度黃芪甲苷干預EPCs，觀察其對EPCs增殖、黏附、成血管及遷移能力的影響，結果發現黃芪甲苷呈濃度依賴性提高EPCs的多種細胞生物學功能，提示黃芪甲苷可能通過提高循環EPCs的數量，增強EPCs的血管新生能力，提高EPCs遷移至損傷內皮并黏附修復的能力以發揮其臨床功效，這為臨床應用黃芪治療缺血性心腦血管疾病提供了新依據。

[1]Arasaha T，masuda H，Takahashi T，et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.Science，1997，275：964

[2]WernerN，JunkS，LaufsU，etal.Intravenous Transfusion of Endothelial Progenitor Cells Reduces Neointima Formation After Vascular Injury.Ciculation Reserch，2003，93（2）：e17

[3]GrieseDP，EhsanA，MeloLG，etal.Isolationand Transplantationof Autologous Circulating Endothelial CellsInto Denuded Vessels and Prosthetic Grafts：Implications for Cell-Based Vascular Therapy.Circulation，2003，108（21）：2710

[4]Shantsila E，Watson T，Lip GY.Endothelial progenitor cells in cardiovascular disorders.J Am Coll Cardiol，2007，49（7）：741

[5]WernerN，KosiolS，SchieglT，etal.Circulatingendothelial progenitor cells and cardiovascular outcomes.N Engl J Med，2005，353（10）：999

[6]Fritzenwanger M，Lorenz F，Jung C，et al.Differential number of CD34+，CD133+and CD34+/CD133+cells in peripheral blood of patientswithcongestiveheartfailure.EurJMedRes，2009，14（3）：113

[7]LiHB，GeYK，ZhangL，etal.Astragaloside I V improved barrier dysfunction induced by acute high glucose in human umbilical vein endothelia l cells.Life Sci，2006，79（12）：1186

[8]高衛真，康毅，婁建石，等.黃芪苷對心肌細胞氧化損傷的保護作用.中國心血管雜志，2005，10（3）：166

編輯：吳寧

R282.710.5文獻識別碼A

1672-397X（2014）03-0076-02

陳聲榮（1973-），男，本科學歷，主治醫師，中西醫結合臨床專業。csr654@163.com

2013-10-29