UPLC法同時測定不同產地大黃中游離蒽醌的含量*

劉炳旺，徐文貴，王 健

（天津醫科大學腫瘤醫院分子影像及核醫學診療科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津 300060）

UPLC法同時測定不同產地大黃中游離蒽醌的含量*

劉炳旺，徐文貴，王 健

（天津醫科大學腫瘤醫院分子影像及核醫學診療科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津 300060）

[目的]建立超高效液相色譜法同時測定13批不同產地大黃中大黃素、大黃酚、大黃酸、大黃素甲醚、蘆薈大黃素等5種游離蒽醌的含量。[方法]采用Waters BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫[0～3 min，19%→25%A，3～10 min，25%→100%A]，流速0.3 mL/min，柱溫30℃，檢測波長254 nm。[結果]大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素分別在1.61～80.30，4.98～249.20，3.27～163.30，9.65～482.50，1.67～83.30 μg/mL范圍內呈現良好的線性關系，平均回收率分別為99.7%，100.4%，100.1%，98.9%，100.9%。相對標準偏差（RSD）分別為1.5%，0.6%，0.8%，0.4%，1.7%。[結論]該方法簡便可行，重復性良好，可用于大黃藥材的質量控制。

大黃；含量測定；超高效液相色譜法

《中國藥典》2010年版（一部）收載的大黃為蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatum L）、唐古特大黃（R.tanguticum Maxim.ex Balf.）或藥用大黃（R.officinale Baill）的干燥根及根莖，具有瀉下攻擊，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經，利濕退黃之功效[1]，為治療熱結便秘之要藥。大黃化學成分復雜，主要含有蒽醌類、蒽酮類、二苯乙烯苷類以及鞣質類化合物，現代藥理研究表明大黃具有抗感染[2]、利膽[3]、止血[3]、抗腫瘤[4]、治療慢性腎功能不全[5-7]等功效，在預防和治療多器官功能不全綜合征和多器官功能紊亂綜合征方面亦有顯著療效[8]。

1 儀器和試藥

安捷倫1290超高效液相色譜儀系統，包括：二元高壓泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器（DAD）等，AX205十萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司），BP121S萬分之一天平（德國塞多利斯公司），超純水機:Mili-QⅡ型（美國Millipore公司），KQ-300B型超聲波清洗器（江蘇昆山分析儀器廠）。對照品大黃酸（110757-200206）、大黃酚（110796-201017）、大黃素（110756-200110）、大黃素甲醚（110758-200912）、蘆薈大黃素（110795-200806）購于中國藥品生物制品檢定所。乙腈（Fisher）、甲酸（TEDIA）均為色譜醇，其他試劑為分析純。大黃藥材購于天津市中藥飲片廠。

2 方法與結果

2.1 混合標準品儲備液的制備 精密稱取大黃酸對照品2.41 mg，蘆薈大黃素對照品2.50 mg分別置于5 mL容量瓶中，加甲醇定溶至刻度，搖勻，即得大黃酸和蘆薈大黃素儲備液。精密稱取大黃酚對照品2.99 mg，大黃素1.96 mg，大黃素甲醚5.79 mg分別置于2 mL容量瓶中，加甲醇定溶至刻度，搖勻，即得大黃酚、大黃素和大黃素甲醚的儲備液。精密量取各儲備液及甲醇1 mL等體積混合，搖勻即得含大黃酸80.3 μg/mL，大黃酚249.2 μg/mL，大黃素163.3 μg/mL，大黃素甲醚482.5 μg/mL，蘆薈大黃素83.3 μg/mL的混合對照品儲備液。

2.2 供試品溶液的制備 將大黃藥材粉碎，過40目篩，精密稱取約0.5 g藥材置50 mL具塞三角瓶中，精密量取25 mL 100%甲醇，稱質量，超聲60 min，放冷后加甲醇補足質量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液即為供試品溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱為WatersBEHC18柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm），流動相：乙睛（A）：0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫[0～3 min，19%→25%A，3～10 min，25%→100%A]，流速：0.3 mL/min，柱溫：30℃，檢測波長：254 nm；進樣量：1 μL。理論塔板數以大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素計算均不低于5 000，5個成分與相鄰峰之間分離度均大于1.5，對稱因子在0.95～1.05之間。對照品及樣品圖譜見圖1，2。

圖1 混合對照品色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard solution

圖2 樣品S1的UPLC色譜圖Fig.2 UPLC chromatogram of sample S1 solution

2.4 線性關系的考察 精密移取混合對照品儲備液，采用逐級稀釋方法，以甲醇配制一系列混合對照品溶液：大黃酸濃度為1.61，4.02，8.03，16.06, 40.15,80.3 μg/mL；大黃酚濃度為4.98，12.46，24.92, 49.83,124.6,249.2 μg/mL；大黃素濃度為3.27，8.17, 16.33,32.67，81.67，163.3 μg/mL；大黃素甲醚濃度為：9.65,24.13,48.25,96.50,241.30,482.50 μg/mL；蘆薈大黃素濃度為1.67,4.17,8.33,16.67,41.67, 83.33 μg/mL。吸取上述系列溶液1 μL注入超高效液相色譜儀，按“2.3”項下色譜條件進行分析。分別以對照品濃度C（μg/mL）為橫坐標，峰面積A為縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算，得大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素的標準曲線回歸方程及線性范圍（見表1），表明各化合物在相應的濃度范圍內線性關系良好。

2.5 精密度實驗 取樣品S1（產地：四川），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，連續進樣6次，以峰面積計算，大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素的相對標準偏差（RSD）分別為0.81%、0.32%、0.62%、1.56%、0.54%。

表1 線性關系實驗結果（n=6）Tab.1 The results of the linear relationship test（n=6）

2.6 穩定性實驗 取樣品S1，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，每2 h進樣1次，以峰面積計算，大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素的RSD（n=7）分別為0.59%、1.34%、1.09%、2.33%、0.37%。結果表明：室溫條件下供試品溶液中各化合物在12 h內穩定。

2.7 重復性實驗 取樣品S1，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，進行測定，結果表明大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素的含量平均值分別為 0.22%，0.50%，0.09%，0.92%，0.12%。RSD分別為0.63%，0.45%，0.55%，0.52%，1.32%。

2.8 加樣回收率實驗 取“2.7”項下重復性實驗已測知含量的藥材粉末0.25 g，置50 mL具塞三角瓶中，分別加入大黃酸對照品0.55 mg、大黃酚對照品1.25 mg、大黃素對照品0.23 mg、大黃素甲醚對照品2.3 mg、蘆薈大黃素對照品0.30 mg，按“2.2”項下方法制備供試溶液，重復5次，結果上述5種化合物平均回收率分別99.7%，100.4%，100.1%，98.9%，100.9%。RSD分別為1.5%，0.6%，0.8%，0.4%，1.7%。

2.9 含量測定 按“2.2”項下方法制備供試品溶液，測定13批不同產地大黃中大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素的峰面積，分別根據各自的標準曲線方程計算含量，每批藥材平行操作2份。結果見表2。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 《中國藥典》2010版規定檢測波長為254 nm，通過文獻及實際操作過程發現254 nm各色譜峰分離較好，280 nm基線也較好，但響應值不如254 nm。

3.2 色譜條件的選擇 實驗中考察了甲醇-0.1%甲酸水系統、乙腈-0.1%甲酸水系統。結果表明乙腈-0.1%甲酸水系統色譜峰分離度較好且柱壓較低，因而選擇乙腈-0.1%甲酸水系統。實驗中還對柱溫進行了考察（25、30、35、40℃），結果表明30℃分離達基線且出峰時間較短。

表2 不同產地大黃含量測定結果Tab.2 The determination results of the different samples %

3.3 提取方法、提取溶劑及提取時間的考察 實驗中比較了超聲和回流提取差別，結果表明超聲30min與回流30 min基本無差異，考慮到超聲方便快捷的優點，最終選擇超聲提取法。實驗中分別采用50%、75%和100%甲醇對大黃藥材進行提取溶媒濃度考察，結果表明100%甲醇對于5種游離蒽醌的提取效率最高。實驗中還考察了提取時間（30、45、60、120 min），結果表明60 min目標化合物峰面積明顯優于30 min和45 min，但120 min與60 min差異不大，表明60 min基本提取完全。

本研究建立了大黃中5種游離蒽醌的UPLC含量測定方法，并應用此方法對不同產地的13個批次藥材進行了評價。結果表明，該方法可行，分離度較高，可用于大黃藥材的快速含量測定。

[1] 衛生部藥典委員會.《中華人民共和國藥典》（2010）[S].北京:化學工業出版社,2010:22.

[2] 瞿佐發.大黃的藥理作用及臨床應用[J].陜西中醫,2002,23(6): 552-554.

[3] 郭望祥.大黃的藥理研究概況[J].江漢大學學報(醫學版),2002,30(2): 60-61.

[4] 丁 艷,黃志華.大黃素的抗腫瘤作用研究進展[J].時珍國醫國藥,2008,19(5):1272-1274.

[5]林嫦娥,趙 強,黃文鄭.大黃及其復方制劑治療慢性腎功能衰竭的臨床研究進展[J].天津中醫藥,2003,20(5):79-80.

[6] 姜 云.大黃、黃芩、黃連、黃柏在現代臨床醫學中的運用[J].天津中醫藥,2008,25（3）:215-216.

[7]韓家強,譚聯聲,王金萍.關于大黃及含大黃方劑治療慢性腎功能不全的臨床研究[J].天津中醫藥,2010,27（3）:194-196.

[8] 景浩然,柴麗娟,郭 虹,等.大黃酸對內毒素激活小膠質細胞的影響[J].天津中醫藥大學學報,2012,31（1）:34-35.

[9]王淑蓓,元恒杰,戚愛棣.HPLC法測定小兒消褪糖漿中大黃酚含量[J].天津中醫藥大學學報,2009,28（2）:89-91.

[10]許舜軍,李鴻燕,曾元兒,等.反相高效液相色譜法測定大黃藥材五種蒽醌類成分的含量[J].時珍國醫國藥,2006,17(7):1201-1202.

[11]王雪芹,趙祖興,陳吉炎,等.武當山5種土大黃中3種蒽醌類成分的含量比較[J].醫藥導報,2010,29(9):1206-1208.

[12]楊月娥,胡文帥,龐 婕,等.道地產區大黃中5種蒽醌類化合物含量測定[J].安徽農業科學,2011,39(11):6378-6379,6429.

[13]王洪蘭,陳 瀚,柴寶娟,等.大黃特征圖譜研究及游離蒽醌含量測定[J].中國民族民間醫藥雜志,2010,19(18):30-31.

Simultaneous determination of free anthraquinones in Rhubarb from different habitats by UPLC

LIU Bing-wang，XU Wen-gui，Wang Jian
（Department of Molecular Imaging and Nuclear Medicine，Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital，National Clinical Research Center of Cancer,Key Laboratory of“Cancer Prevention and Therapy”，Tianjin 300060，China）

[Objective]To develop a UPLC method for simultaneous determination of five anthraquinones(Rhein，Chrysophanol，Emodin，Physcion and Aloe-emodin)in Radix et Rhizom a Rhei from different habitats.[Methods]The analysis was performed on Waters BEH C18column(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)with a gradient mobile phase of acetonitrile(A)-0.1%Formic acid solution(B)(0～3 min，19%→25% A，3～10 min，25%→100%A)at flow rate of 0.3 mL/min.The column was maintain at 30℃and the detection wavelength was set at 254 nm.[Results]The linear ranges were 1.61～80.30 μg/mL for Rhein，4.98～249.20 μg/mL for Chrysophanol，3.27～163.30 μg/mL for Emodin，9.65～482.50 μg/mL for Physcion and 1.67～83.30 μg/mL for Aloe-emodin.The average recoveries of the five compounds were 99.7%，100.4%，100.1%，98.9%，100.9%and RSD were 1.5%，0.6%，0.8%，0.4%，1.7%respectively.[Conclusion]The rapid and accurate UPLC method was established.This method can be used to assess the quality of Rhubarb.

Rhubarb；determination；UPLC

R284

：A

：1672-1519（2014）04-0238-03

2013-12-13）

（本文編輯：高 杉，馬 英）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.04.15

國家自然科學基金資助項目（30872954），天津市衛生局科技基金資助項目（2012KZ064）。

劉炳旺（1981-），男，藥師，主要從事正電子藥物的生產及藥物分析。

徐文貴，E-mail：wenguixy@tom.com。