自噬對(duì)電針治療大鼠實(shí)驗(yàn)性坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生的影響*

趙 偉，劉延祥，王占魁，王 蕊，郭 義

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，天津 300193）

自噬對(duì)電針治療大鼠實(shí)驗(yàn)性坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生的影響*

趙 偉，劉延祥，王占魁，王 蕊，郭 義

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，天津 300193）

[目的]研究自噬在電針治療周圍神經(jīng)再生中的作用。[方法]通過(guò)手術(shù)造成大鼠實(shí)驗(yàn)性坐骨神經(jīng)鉗夾傷模型，采用電針治療，自噬抑制劑三甲基腺嘌呤（3-MA）干預(yù)等措施，不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（STI）測(cè)定和再生神經(jīng)組織學(xué)觀察。[結(jié)果]組間比較發(fā)現(xiàn)，在實(shí)施干預(yù)后第7天和第28天，電針聯(lián)合自噬抑制劑組的SFI比其他各組更差（P＜0.05）。組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，模型組、電針組在第1、2、7天時(shí)的SFI無(wú)差異，均在第28天時(shí)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；而電針聯(lián)合自噬抑制劑組在第1、2天時(shí)的SFI無(wú)差異，但在第7、28天時(shí)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）且劣于上述各組。另外，再生神經(jīng)組織的蘇木精-伊紅（HE）染色切片和鍍銀染色切片顯示，第28天時(shí)，電針聯(lián)合自噬抑制劑組的再生神經(jīng)組織和神經(jīng)纖維的連續(xù)性和密集程度較其他各組要差。[結(jié)論]電針在坐骨神經(jīng)功能的長(zhǎng)期恢復(fù)中發(fā)揮較大作用。在相同電針情況下，抑制自噬反應(yīng)對(duì)坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)和形態(tài)改善造成較大負(fù)面影響，說(shuō)明電針可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬來(lái)改善坐骨神經(jīng)功能及組織形態(tài)。

自噬；電針；神經(jīng)再生；坐骨神經(jīng)功能指數(shù)；組織學(xué)

周圍神經(jīng)再生與修復(fù)一直是困擾醫(yī)學(xué)界的難題之一，臨床多用藥物和手術(shù)治療[1]。目前，電針治療周圍神經(jīng)再生的臨床療效也已肯定[2]，但其機(jī)制尚不明確，本團(tuán)隊(duì)一直致力于此方面的研究。自噬是近年來(lái)分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)，自噬對(duì)神經(jīng)細(xì)胞存活、清除神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)衰老細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊蛋白等起重要作用，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[3]。通過(guò)文獻(xiàn)研究認(rèn)為，探索自噬在電針治療周圍神經(jīng)再生中的具體作用及其可能機(jī)制，具有重要的研究?jī)r(jià)值[4]。鑒于此，課題組在前期研究的基礎(chǔ)上，開展了電針治療周圍神經(jīng)再生與自噬關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究，以探討其作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 根據(jù)醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本量計(jì)算，查詢文獻(xiàn)及可能死亡動(dòng)物數(shù)估算后，購(gòu)進(jìn)無(wú)菌級(jí)Wistar健康大鼠96只（由北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心下屬維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供），體質(zhì)量（180±20）g，雄性，大鼠購(gòu)進(jìn)后，先籠養(yǎng)7 d，以適應(yīng)環(huán)境。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：正常組、模型組、電針組、電針聯(lián)合自噬抑制劑三甲基腺嘌呤（3-MA）組，每組各24只。

1.3 模型制備 大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后固定，常規(guī)備皮，碘伏消毒后，于右后肢后外側(cè)縱行切開皮膚，鈍性分離股二頭肌。在手術(shù)顯微鏡下距梨狀肌下緣8 mm處，游離出約2 cm坐骨神經(jīng)。用1～2滴水合氯醛局麻神經(jīng)，用特制紋鉗完全閉合鉗夾坐骨神經(jīng)3次，每次30 s，中間間隔5 s，鉗夾段長(zhǎng)度為3 mm，寬度1 mm。松開血管鉗后見(jiàn)鉗夾段神經(jīng)完全透明，但神經(jīng)外膜處未見(jiàn)出血。顯微鏡下，達(dá)到神經(jīng)損傷Sunderland分類4度水平。生理鹽水沖洗傷口，常規(guī)分層縫合肌肉、皮膚、包扎。于術(shù)后第2天進(jìn)行分組治療。

1.4 治療方法 正常組常規(guī)飼養(yǎng)；模型組不給予任何治療，與治療組進(jìn)行相同的捆綁；電針組采用電針治療；電針聯(lián)合自噬抑制劑3-MA組在電針治療前30 min腹腔注射3-MA（0.5 mg/kg）。電針治療措施具體如下：以《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》的穴位定位為依據(jù)[5]，參照相關(guān)選穴原則[6]，于損傷神經(jīng)干的肢體兩端分別選取“環(huán)跳”穴、“足三里”穴，用1.5寸（同身寸）的針灸針，刺入0.5～1 cm深，行提插捻轉(zhuǎn)手法。使用全能脈沖電療儀（華佗牌SDZ-Ⅱ型，產(chǎn)地蘇州），正、負(fù)電極輸出線分別夾在“環(huán)跳”、“足三里”穴位上的毫針針柄上。選用斷續(xù)波型，電針頻率為5 Hz（參照前期研究[7]），電流強(qiáng)度以肌肉出現(xiàn)輕微抽動(dòng)為準(zhǔn)。每次刺激時(shí)間為15 min，每日1次，每周6次，共治療4周。

1.5 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI）測(cè)定 參照文獻(xiàn)[8]的方法自制大鼠足印行走箱，讓后足浸染碳素墨水的大鼠在內(nèi)行走，測(cè)定雙側(cè)足印長(zhǎng)度（從足跟到足尖的最長(zhǎng)距離，用PL表示，E表示傷側(cè)，N表示健側(cè)）、足趾寬度（第1到5趾連線距離，用TS表示）及中間足趾距離（第2到5趾連線距離，用IT表示)，代入Bain公式：

SFI＝－38.3×（EPL－NPL）÷NPL＋109.5×（ETSNTS）÷NTS＋13.3×（EIT－NIT）÷NIT－8.8，最終計(jì)算出SFI。

1.6 組織學(xué)觀察 大鼠脫椎處死，于兩后肢外側(cè)剪開皮膚，暴露大腿梨狀肌，撥開梨狀肌找到坐骨神經(jīng)，于神經(jīng)損傷點(diǎn)遠(yuǎn)側(cè)1 cm處盡量截取足夠長(zhǎng)的神經(jīng)組織放入4%多聚甲醛溶液中固定。做成石蠟切片，分別進(jìn)行再生神經(jīng)組織蘇木精-伊紅（HE）染色和鍍銀染色，封片，鏡檢。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 18.0軟件包統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SFI的結(jié)果 見(jiàn)表1。因SFI計(jì)算結(jié)果均為負(fù)值，為便于統(tǒng)計(jì)，表1取其正值，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）顯示。表中，“電＋抑組”代表“電針聯(lián)合自噬抑制劑3-MA組”。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)SFI正值的比較（±s）

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)SFI正值的比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；電針組和“電＋抑組”比較，▲▲P＜0.01，▲P＜0.05；與第1天數(shù)據(jù)比較時(shí)，##P＜0.01，#P＜0.05。

組別 n 1 d 2 d 7 d 28 d正常組 24 17.83±06.41 15.05±06.15 14.35±06.80 11.50±03.37模型組 24 73.33±19.40**76.11±15.52**68.04±09.41** 27.92±12.88*##電針組 24 78.12±06.70**74.28±13.94**72.85±15.94** 06.41±02.77##電＋抑組 24 70.37±08.12**69.03±10.80**95.62±07.83**▲#36.21±05.51*▲▲#

組間比較結(jié)果顯示，第1、2、7天時(shí)，正常組SFI正值與其他各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。第7天時(shí)，“電＋抑組”SFI正值與電針組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。第28天時(shí)，“電＋抑組”SFI正值與電針組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

組內(nèi)比較結(jié)果顯示，模型組和電針組在第28天時(shí)的SFI正值與第1天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。“電＋抑組”在第7、28天時(shí)的SFI正值與第1天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 再生神經(jīng)組織學(xué)切片 圖1和圖2中，“電＋抑”代表“電針聯(lián)合自噬抑制劑3-MA組”。HE染色可見(jiàn)，第28天時(shí)，電針組再生的神經(jīng)組織較模型組更豐富，完整性更好。而電＋抑組再生的神經(jīng)組織雖然豐富，但較模型組和電針組的組織連續(xù)性要差。

鍍銀染色可見(jiàn)，第28天時(shí)，電針組再生的神經(jīng)纖維較模型組更密集，完整性和連續(xù)性更好。而電＋抑組再生的神經(jīng)纖維較模型組和電針組明顯稀疏，且完整性和連續(xù)性很差。

3 討論

SFI是評(píng)價(jià)大鼠坐骨神經(jīng)再生與功能恢復(fù)的準(zhǔn)確而可靠的指標(biāo)[8]。通過(guò)SFI正值的組間比較發(fā)現(xiàn)，第1、2、7天時(shí)，正常組與其他各組比較，差異有顯著性（P＜0.01），說(shuō)明坐骨神經(jīng)損傷后，早期功能恢復(fù)較差。第1、2天時(shí)，除正常組外，其余各組坐骨神經(jīng)功能均較差且無(wú)差異（P＞0.05）。第7天時(shí)，電針聯(lián)合自噬抑制劑3-MA組的坐骨神經(jīng)功能更差且劣于電針組（P＜0.05）。提示抑制自噬反應(yīng)對(duì)電針治療坐骨神經(jīng)的功能恢復(fù)造成較大影響。第28天時(shí)，電針組的坐骨神經(jīng)功能基本恢復(fù)正常，與正常組比無(wú)差異（P＞0.05），說(shuō)明電針在坐骨神經(jīng)功能的長(zhǎng)期恢復(fù)中發(fā)揮了較大作用。另外，第28天時(shí)，電針聯(lián)合自噬抑制劑3-MA組的坐骨神經(jīng)功能更明顯劣于電針組（P＜0.01），進(jìn)一步提示抑制自噬反應(yīng)對(duì)電針治療坐骨神經(jīng)的功能恢復(fù)造成較大負(fù)面影響。通過(guò)SFI組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，模型組、電針組在第1、2、7天時(shí)的坐骨神經(jīng)功能無(wú)差異，均在第28天時(shí)出現(xiàn)顯著差異（P＜0.01），說(shuō)明坐骨神經(jīng)功能的短期恢復(fù)能力差，長(zhǎng)期方可見(jiàn)效。另外，電針＋自噬抑制劑3-MA組在第1、2天時(shí)的坐骨神經(jīng)功能無(wú)差異，但在第7、28天時(shí)出現(xiàn)明顯差異（P＜0.05）且劣于上述各組，提示抑制自噬反應(yīng)延遲了電針治療坐骨神經(jīng)的功能恢復(fù)。

Lu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠再生的坐骨神經(jīng)主要通過(guò)細(xì)胞自噬來(lái)維持正常形態(tài)。而Marinelli等[10]發(fā)現(xiàn)，自噬抑制劑3-MA恰恰通過(guò)抑制自噬起相反的作用。在本實(shí)驗(yàn)中，從第28天組織學(xué)HE染色和鍍銀染色切片可見(jiàn)，電針組再生的神經(jīng)組織和神經(jīng)纖維形態(tài)明顯優(yōu)于模型組，提示電針可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬改善了再生神經(jīng)形態(tài)，而電針聯(lián)合自噬抑制劑3-MA組再生的神經(jīng)組織和神經(jīng)纖維形態(tài)明顯劣于模型組和電針組，說(shuō)明3-MA抑制細(xì)胞自噬的同時(shí)可能阻礙了電針改善神經(jīng)組織形態(tài)的作用。

圖1 第28天神經(jīng)組織切片圖（HE染色，×200）

圖2 第28天神經(jīng)纖維切片圖（鍍銀染色，×200）

筆者認(rèn)為，電針在坐骨神經(jīng)功能的長(zhǎng)期恢復(fù)中發(fā)揮了較大作用，抑制自噬對(duì)電針促進(jìn)坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)和神經(jīng)組織形態(tài)改善均會(huì)造成不利影響，反之提示，電針可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬來(lái)改善坐骨神經(jīng)功能及組織形態(tài)。

目前，有關(guān)電針與周圍神經(jīng)之間關(guān)系的研究很多。臨床研究主要基于神經(jīng)功能恢復(fù)和療效觀察，如朱長(zhǎng)山[11]、孫冬瑋等[12]報(bào)道電針能有效治療神經(jīng)痛，鄒華婭等[13]報(bào)道電針能有效治療神經(jīng)損傷，快速改善患者臨床癥狀，而實(shí)驗(yàn)研究主要集中在電針對(duì)周圍再生神經(jīng)的形態(tài)、功能、分子機(jī)制等方面的影響，特別是近些年在分子機(jī)制方面的研究比例明顯增加，觀察對(duì)象包括神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[14]、相關(guān)代謝分子[15]、酶[16]、自由基[17]、黏附分子[18]等，但以上研究均未涉及細(xì)胞自噬。本研究從功能學(xué)和形態(tài)學(xué)角度表明，自噬在電針治療周圍神經(jīng)再生過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用，而關(guān)于其分子機(jī)制問(wèn)題將進(jìn)一步深入開展下去。

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Influence of autophagy on nerve regeneration induced by electric acupuncture treatment in rats with experimental sciatic nerve injury

ZHAO Wei，LIU Yan-xiang，WANG Zhan-kui，WANG Rui，GUO Yi
（School of Traditional Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To study the role of autophagy in electric acupuncture treatment of peripheral nerve regeneration.[Methods]The experimental clamped injury of sciatic nerve was induced in rats through operation.Intervention was given with electric acupuncture treatment，autophagy inhibitor 3-MA.After that treatment at different time points the functional indexes of sciatic nerve(SFI)were determined and the histology of regeneration of nerve was observed.[Results]The comparison between groups found that the SFI in electric acupuncture combined with autophagy inhibitor was more less than other groups(P＜0.05).The comparison of inter-groups revealed that the SFI in model group and electric acupuncture group at the first,second and seventh day was not significantly different.All of them were become different at twenty-eight day(P＜0.01).The level of SFI in electric acupuncture combined with autophagy inhibitor was not different at the first and second day but at the 7th and 28th day become significantly different(P＜0.05)and was less than the above groups.In addition，the biopsy of regenerative nerve tissue stained by HE and silver was showed that the continuity and intensity of regenerative nerve tissue and nerve fibers of electric acupuncture＋autophagy inhibitor group was inferior to other groups on 28th day.[Conclusion]The electric acupuncture plays a important role in the course of long-term recovery of sciatic nerve functions.Under the same condition of electric acupuncture，the inhibition of autophagy will produce a larger negative effect for the functional recovery and structural improvement of sciatic nerve,suggesting that the functional recovery and structural improvement can be promoted through cellular autophagy.

autophagy；electric acupuncture；nerve regeneration；sciatic nerve function index；histology

R284

：A

：1673－9043（2014）06－0351-04

2014-08-15）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.06.09

國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目（81173204）；天津市高等學(xué)校科技發(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目（20110218）。

趙 偉（1977-），男，博士，講師，研究方向?yàn)獒樉幕A(chǔ)、神經(jīng)再生、人體解剖學(xué)。

郭 義，E-mail:guoyi_168@163.com。