SELEX技術篩選甲基苯丙胺適配子

陸鑫蔚，胡小龍，張玉榮，孫美琪，曹芳琦，黃琴蓉，曾立波

（1.中國醫藥工業研究總院上海醫藥工業研究院 創新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海200437；2.上海市公安局物證鑒定中心 上海市現場物證重點實驗室，上海200083）

甲基苯丙胺（methamphetamine）俗稱冰毒，是一種依賴性極高的精神活性物質，是國家嚴控的一類精神藥品和麻醉藥品（國食藥監安2005年481號文件）。目前，國際上苯丙胺類物質的濫用呈不斷上升趨勢。專家們預測，苯丙胺類興奮劑將成為21世紀最廣泛濫用的藥物[1]。由于現在研發的甲基苯丙胺膠體金標單抗試劑盒都會有不同程度的交叉反應，所以本課題旨在研究針對甲基苯丙胺特異性結合的適配子，為研發高度特異性甲基苯丙胺適配子試劑盒奠定基礎。

核酸適配子（Aptamer）是體外化學合成并能與靶分子特異性結合的單鏈DNA或RNA寡核苷酸分子。針對結構相似的物質，適配子的特異性及親和性都優于抗體。SELEX（配體指數增強系統進化技術）是Tuerk和Gold[2]在1990年分別研究的一種新的組合化學技術，其應用大容量的隨機寡核苷酸文庫，并結合體外PCR擴增技術，以指數級富集與靶分子特異結合的寡核苷酸，經過多輪篩選，獲得高親和力、特異性強的寡核苷酸適配子[3]。目前，該技術已被成功地用于篩選各種靶物質的結合序列，包括小分子[4]、蛋白質[5]、無機物[6]等等。篩選到的小分子物質的適配子包括藥物（可卡因[7]）、毒物（蛤蚌毒素[8]）、農藥（毒死蟬[9]）等的適配子。小分子毒品毒物的適配子篩選難度較大，目前報道較少，所以本研究旨在運用SELEX技術從合成的隨機單鏈DNA（ssDNA）文庫中篩選到針對甲基苯丙胺的特異性適配子，為小分子毒品毒物適配子的篩選提供一個技術平臺。

1 材料和方法

1.1 材料

體外設計和合成76 bp的隨機ssDNA文庫：5’-GCG GAT GAA GAC TGG TCT-N40-GCC CTA AAT ACG AGC AAC-3’，上游引物 F：5’-FAM-GCGGATGAAGACTGGTCT-3’，下游引物 R：5’-Biotin-GTTGC TCGTATTTAGGGC-3’。文庫和引物合成（上海英駿生物技術有限公司）。試劑中所用膠純化試劑盒、鏈霉親和素磁珠、溴化氰活化瓊脂糖、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、N-乙基-N-（二甲氨基丙基）碳二亞胺（EDC）都購于Sigma公司；2×PCR mix（天根生物有限公司）；甲基苯丙胺完全抗原（杭州隆基生物技術有限公司）；DNA序列測定（上海英駿生物技術有限公司）。

1.2 儀器

Veriti PCR儀（美國AB公司）；全自動凝膠成像分析儀（英國Syngene公司）；Tanon電泳儀（廣州譽維生物科技儀器有限公司）；振蕩培養箱（SHEL LAB）、BI-3000。型表面等離子體共振儀（Biosensing Instrument Inc）。

1.3 方法

1.3.1 甲基苯丙胺完全抗原與溴化氰活化瓊脂糖偶聯

稱2 g溴化氰活化瓊脂糖，活化后與5 mg甲基苯丙胺完全抗原孵育過夜，用0.1M NaHCO3（含0.5 M NaCl）洗滌，離心半徑 13.5 cm，3 000 r/min 離心 5 min，棄上清。用0.2M甘氨酸進行封閉過夜。封閉后用結合緩沖液（20mmol/LTris-HCl，137mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，2mmol/L CaCl2， 1mol/L MgCl2）洗滌，洗滌完裝入親和層析柱中。按如上方法制備含BSA的親和層析柱作為陰性柱。

1.3.2 SELEX篩選

（1）結合：將200 pmol/L的ssDNA庫95℃熱變性10 min，迅速冷卻到0℃，5 min之后將ssDNA文庫先加入陰性柱進行反篩選，收集液體再加入含甲基苯丙胺的柱子，用Binding Buffer洗3次。

（2）洗脫：加入 100 μg/mL 甲基苯丙胺進行洗脫，收集洗脫液進行PCR。

（3）PCR反應：PCR反應體系：ssDNA模板23 μL，上游引物1μL，下游引物1μL，2×PCR緩沖液25 μL。PCR反應條件：95℃預變性3min，25個循環的95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸3 min。

（4）純化：將PCR產物走2%的瓊脂糖凝膠，把想要的膠切下并純化。

（5）ssDNA次級庫的合成：將純化后的帶生物素的dsDNA與鏈霉親和素磁珠在1×B&W緩沖液（pH7.5，10mM Tris-HCL，1mM EDTA，2M NaCl） 室溫條件下結合30min左右。用1×B&W緩沖液洗滌2～3次，加入 150 mM NaOH 37℃孵育 15 min，使 dsDNA解鏈，用磁力架分離，使含生物素的一條ssDNA留在鏈霉親和素磁珠上，而另一條不帶生物素的ssDNA用于下一輪篩選的次級文庫。

（6）重復以上步驟10輪。

1.3.3 SPR檢測結合率

（1）CM5傳感片的包被：2 mM巰基乙胺1 mL滴在金膜上孵育12 h，再將15 mM NHS和75 mM EDC（新鮮配制）與6 mg/mL CM-dextran進行混合并滴在金膜表面3 h。

（2）結合率的測定：流速控制在 40 μL/min，先通過一段連續的結合緩沖液沖洗直至基線穩定。當基線穩定后，注射含0.4M EDC和0.1M NHS的氨基偶聯試劑200μL，活化CM5傳感片上的羧基。將甲基苯丙胺完全抗原用結合緩沖液稀釋至5mg/mL，注射該溶液200μL，由于甲基苯丙胺完全抗原上BSA的氨基與傳感片上活化的酯基發生氨基偶聯反應而使甲基苯丙胺被固定在傳感片上。注射200μL的1M乙醇胺溶液，用來封閉金膜上尚未發生偶聯反應的酯基。最后注入200μL的結合緩沖液除去非特異吸附的乙醇胺。將第1輪到第10輪的ssDNA分別注入SPR儀中，與金膜表面上的甲基苯丙胺作用一段時間，用20mM的NaOH再生液使基線恢復，實時采集響應信號。重復以上相同步驟來檢測BSA（陰性對照）是否結合適配子。

1.3.4 克隆和測序

最后一輪篩選的產物經PCR擴增純化后，連接到pUC-T載體上，在轉化到感受態細胞DH5α中，通過培養、藍白斑篩選，挑出10個白色菌落，搖菌，對菌液提取質粒進行電泳驗證，挑出10個陽性克隆進行序列測定（上海英駿生物技術有限公司測定）。

1.3.5 適配子結構預測與分析

將測序獲得的適配子序列用Clustal X和MFOLD[10]軟件分析適配子一級結構的同源性，并進行二級結構的預測。

2 結果

2.1 PCR條件優化結果

結果發現，不同的退火溫度、循環次數、模板量均會影響ssDNA擴增為dsDNA的PCR擴增效果，在每一輪篩選的PCR過程中，都應該經過2%的瓊脂糖凝膠電泳確定目的條帶最亮，無非特異性擴增的最佳PCR條件后，再大量擴增用于下一輪的篩選。將退火溫度分別設為 53℃，55℃，57℃，59℃，61℃時，由圖1可見，退火溫度為55℃時條帶最清晰、明亮，且非特異性少，所以選擇55℃為最優退火溫度。將每輪PCR產物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳顯示（見圖2），在100bp以下均出現預期的單一條帶（理論為76bp），條帶隨著輪數的增加而越來越致密且單一。

圖2 第1～10輪PCR產物的2%瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.2 SPR檢測結合率的結果

用SPR檢測每輪ssDNA文庫與甲基苯丙胺完全抗原的親和力，陰性對照使用BSA檢測每輪ssDNA文庫，圖3可見，RU值從第1輪的88.3上升到第8輪的110.9，呈上升趨勢。自第8輪之后的兩輪的RU值無明顯變化，說明適配子與甲基苯丙胺完全抗原的結合親和力達到飽和。BSA的陰性對照顯示每輪ssDNA文庫與BSA完全沒有響應，說明我們篩選出的適配子只和甲基苯丙胺結合，不和BSA結合。

圖3 SPR測定每輪ssDNA和甲基苯丙胺完全抗原的結合率

2.3 甲基苯丙胺完全抗原適配子的測序結果和二級結構的分析

經分析，有10個克隆子測序成功。如表1所示，A05、B09-891、E06-924 和 H11 的序列是一致的，B03和F07-937的序列是一致的，G06和G11的序列是一致的。

表1 適配子測序結果

圖4 甲基苯丙胺適配體二級結構

通過軟件預測了5個有活性的適配子的二級結構（見圖4），發現這些預測的結構圖都含有莖-環結構。可分為兩類：第一類為A05，B03和E08，主要是5’端和3’端的固定序列形成了一個大的環狀結構，中間隨機序列形成了莖-環結構；第二類為E01和G06，主要是5’端和3’端的固定序列分別和隨機序列形成了莖-環結構。

3 討論

適配子是通過SELEX技術篩選出來的一段寡核苷酸序列。它的穩定性、親和力和特異性都優于抗體；制備適配子可以通過體外篩選，無需免疫動物；變性與復性可逆；無批間差異；可修飾并易于長期保存和室溫運輸等。一般用于SELEX技術篩選的寡核苷酸鏈文庫有3種：隨機RNA文庫、經修飾的RNA文庫和ssDNA文庫。本研究采用的ssDNA文庫全長76 bp，中間為40 bp的隨機核苷酸序列，由A、G、C、T密碼子隨機組合，這樣可能有440個理論組合，即理論庫容量為1015，足以滿足篩選適配子的需求。大分子物質如蛋白、細胞等適配子的篩選采用離心、沉淀的方法就可以篩選得到，而小分子物質首先必須將其固定或包被在固相載體上，制成親和介質后方可進行SELEX篩選。本研究采用小分子的完全抗原進行篩選，利用BSA將小分子固定在親和層析柱上，克服了小分子難以固定在固相介質的難題，為了去除與固相介質結合和BSA的非特異性反應，我們在每2輪篩選后進行一次反篩選，即用次級文庫先與偶聯BSA的親和層析柱結合反應一定時間后，再與偶聯甲基苯丙胺完全抗原的親和層析柱進行篩選，反篩對于從復雜的核酸序列中篩選針對靶分子的特異的適配子價值較大，即降低了篩選背景，又增加SELEX篩選的嚴謹性，所以進行反篩選是必不可少的。

SELEX篩選第一輪使用的文庫為合成的隨機寡核苷酸文庫，次級文庫主要來源于：（1）生物素-鏈霉親和素磁珠分離法；（2）不對稱PCR法。有報道稱，隨著篩選輪數增加，不對稱PCR得到的產物非特異性明顯增加，該法得到的ssDNA文庫不夠穩定[11]。所以，我們采用了生物素-鏈霉親和素磁珠分離法制備次級文庫。

經過10輪的篩選，瓊脂糖凝膠電泳驗證發現，隨著輪數的增加，條帶越來越清晰明亮，說明適配子的特異性也在逐步提高。通過用SPR測定每輪ssDNA文庫和甲基苯丙胺完全抗原的結合率結果顯示，結合率從88．3 RU上升到113．7 RU；說明得到了與甲基苯丙胺特異結合的適配子。獲得的適配子進行測序，得10個序列，二級結構均為莖-環結構，可能是適配子和甲基苯丙胺結合的結構基礎。

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