盆炎灌腸方對子宮內膜細胞炎癥模型抗炎作用的實驗研究*

趙 琳，王雅楠，宋殿榮

（天津中醫藥大學第二附屬醫院婦科，天津 300150）

盆炎灌腸方對子宮內膜細胞炎癥模型抗炎作用的實驗研究*

趙 琳，王雅楠，宋殿榮

（天津中醫藥大學第二附屬醫院婦科，天津 300150）

[目的]研究盆炎灌腸方對子宮內膜細胞炎癥模型的抗炎作用。[方法]運用細菌脂多糖（LPS）誘導人子宮內膜細胞制作炎癥模型，分為3組，正常對照組、炎癥模型組、實驗組，培養72 h，檢測各組細胞因子白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的濃度和細胞因子IL-1β、TNF-α mRNA表達及核轉錄因子p65（NF-κB p65）蛋白表達。[結果]盆炎灌腸方可顯著降低炎癥模型組炎癥細胞因子IL-1β、TNF-α的分泌及其mRNA的表達，明顯抑制炎癥模型組細胞核中NF-κB p65蛋白表達水平。[結論]盆炎灌腸方對子宮內膜細胞炎癥模型具有明顯的抗炎作用，且此作用可能與NF-κB途徑相關。

盆炎灌腸方；子宮內膜細胞；炎癥模型；IL-1β；TNF-α；NF-κB

盆腔炎性疾病（PID）是指女性上生殖道及其周圍組織的炎癥，嚴重影響婦女健康，主要有子宮內膜炎、輸卵管炎、輸卵管卵巢膿腫、盆腔腹膜炎。炎癥可局限于盆腔某一個部位，也可以同時累及幾個部位。PID若未能得到及時正確的治療，則可由于盆腔粘連，輸卵管阻塞，導致不孕、輸卵管妊娠、慢性盆腔痛，炎癥反復發作等PID后遺癥（SPID），其防治已成為婦科領域亟待解決的重要課題[1]。盆炎灌腸方在長期臨床應用中取得顯著療效，本研究觀察了盆炎灌腸方對子宮內膜細胞炎癥模型的抗炎作用,初步探討其抗炎機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本 子宮內膜組織取自因子宮肌瘤行婦科手術前診斷性刮宮的女性，共30例，患者無內分泌疾病及全身性疾病,月經周期規律，刮宮前3個月未服用激素類藥物,標本在30 min內低溫進行處理，內膜病理診斷未發現子宮內膜病理改變。

1.1.2 實驗藥物 盆炎灌腸方（紅藤、敗醬草、丹參、三棱、莪術、水紅花子、川楝子、延胡索），由天津中醫藥大學第二附屬醫院提供，用超純水配成1 g/mL藥液，滅菌，4℃保存備用。

1.1.3 實驗主要試劑 DMEM/F12（1∶1）培養基（HyClone，美國），胎牛血清（FBS，HyClone，美國），0．25%Trypsin－EDTA（Invitrogen，美國），Collagenase TypeⅠA（Sigma，美國），脂多糖（LPS，Sigma，美國），白介素-1β（IL－1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF－α）酶聯免疫吸附測定法（ELISA）試劑盒（西唐，上海），Quant一步法逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT－PCR）試劑盒（天根，北京），核轉錄因子κB（NF－κB）p65抗體（Santa Cruz，CA）。

1.1.4 實驗主要儀器 單人超凈工作臺（上海樹立），二氧化碳培養箱（上海三發），倒置顯微鏡（上海光學儀器廠），PCR儀（美國應用生物系統公司），酶標儀（山東高密），電泳儀（北京凱元），凝膠電泳成像儀（北京賽智），電泳系統購自Bio-Rad，Imager Master VDS圖像分析儀（AlphaInno－tech）。

1.2 方法

1.2.1 人子宮內膜細胞的培養 參照文獻[2]的方法并加以改進。將組織用Hanks液洗滌直至漂洗液中無血跡為宜，剪成小碎塊，加入復合消化酶，37℃水浴消化，吸取上清液加FBS終止消化，過篩網，重復消化3次，消化液離心，1 000 r/min，5 min，棄上清液，加入培養基（含10%FBS），接種于培養瓶，24 h后換液，每48 h換液，觀察。

1.2.2 子宮內膜細胞炎癥模型的建立 接種于培養板中處于對數生長期的細胞，隨機分為兩組，正常對照組和炎癥模型組，每組設置平行4個樣本。根據文獻[3]所確定LPS最佳濃度，炎癥模型組加入濃度為100ng/mLLPS，正常對照組加入等量培養液，收集細胞培養液，離心取上清液進行ELISA分析。

1.2.3 盆炎灌腸方對子宮內膜細胞炎癥模型的影響 將培養板中處于對數生長期的子宮內膜細胞，隨機分為3組，正常對照組、炎癥模型組、實驗組，每組均設置平行4個樣本。炎癥模型組如上述方法添加LPS誘導劑，實驗組加入100 ng/mL LPS誘導劑和5 mg/mL的盆腔灌腸方，正常對照組加入等量的培養液（含10%FBS）。培養72 h后，收集各組的細胞培養上清液，1 000 r/min離心后，進行IL－1β、TNF－α的檢測。取單層細胞進行 TNF－α、IL－1β mRNA的檢測，RT－PCR法測定其表達。取單層細胞進行核蛋白提取，Western blot法檢測NF－κB p65的蛋白表達。

1.2.4 統計方法 采用SPSS 17．0統計軟件包進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，單因素設計計量資料的組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較時，若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’sT3法，重復測量設計的計量資料采用重復測量方差分析，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮內膜細胞光鏡觀察的結果 貼壁生長的腺上皮細胞呈蝌蚪形或多角形（見圖1A），3 d后，長成旋渦狀排列的致密單層細胞集落（見圖1B）。7 d時，細胞伸長，細胞集落擴大并相互融合成片（見圖1C），傳2～3代后腺上皮細胞逐漸減少消失，間質細胞明顯增生，間質細胞顯微鏡下可見兩種形態:呈多角形或星形（見圖1D，圖1E），2～3次傳代后，細胞伸長成梭形（見圖1F）；另一種為梭形細胞，長期連續培養后，細胞延伸呈梭形，相互平行排列成束，密度大的區域細胞聚集成堆（見圖1G）。

2.2 子宮內膜細胞炎癥模型的建立 正常對照組子宮內膜細胞在培養期間持續分泌IL－1β、TNF－α，但含量較低，且分泌IL－1β、TNF－α隨時間變化差異無統計學意義（P＞0．05）；0 h及24 h時間段炎癥模型組分泌IL－1β、TNF－α未見明顯升高，與同時間段正常對照組差異無統計學意義（P＞0．05）；48 h及72 h時間段炎癥模型組分泌IL－1β、TNF－α顯著升高，明顯高于同時段正常對照組（P＜0．05）；且在72 h時炎癥模型組IL－1β、TNF－α達到最高，明顯高于0、24、48h時IL－1β、TNF－α（P＜0．05），提示造模成功。見表1～2。

表1 LPS對人子宮內膜細胞培養液IL-1β濃度的影響（±s）Tab.1 Effect of LPS on the IL-1β concentration in endometrium cell culture fluid（±s）pg/mL

表1 LPS對人子宮內膜細胞培養液IL-1β濃度的影響（±s）Tab.1 Effect of LPS on the IL-1β concentration in endometrium cell culture fluid（±s）pg/mL

注：與正常對照組0 h比較，*P＜0．05；與同時間段正常對照組比較，#P＜0．05；與炎癥模型組72 h比較，▲P＜0．05。

組別 時間0 h 24 h 48 h 72 h正常對照組581．40±11．44592．03±12．35 579．37±15．39 599．67±9．16炎癥模型組585．03±6．16#603．43±5．68#1 033．02±28．52*#▲1315．23±16．08*#

表2 LPS對人子宮內膜細胞培養液TNF-α濃度的影響（±s）Tab.2 Effect of LPS on TNF-α concentration in endometrium cell culture fluid(±s)pg/mL

表2 LPS對人子宮內膜細胞培養液TNF-α濃度的影響（±s）Tab.2 Effect of LPS on TNF-α concentration in endometrium cell culture fluid(±s)pg/mL

注：與正常對照組0 h比較，*P＜0．05；與同時間段正常對照組比較，#P＜0．05；與炎癥模型組72 h比較，▲P＜0．05。

組別 時間0 h 24 h 48 h 72 h正常對照組 63．73±0．82 62．79±0．65 62．86±1．89 65．28±0．24炎癥模型組 63．89±0．22#65．23±0．15#229．90±4．98*#▲289．30±3．08*#

圖1 子宮內膜細胞形態Fig.1 The morphology of endometrium cell

2.3 盆炎灌腸方對子宮內膜細胞炎癥模型的影響

2.3.1 盆炎灌腸方對子宮內膜細胞炎癥模型分泌細胞因子的影響 在盆炎灌腸方的作用下，實驗組細胞分泌IL－1β、TNF－α明顯低于炎癥模型組，差異有統計學意義（P＜0．05），與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），可見盆炎灌腸方有明顯的抑制炎性因子分泌的作用。見表3。

表3 盆炎灌腸方對人子宮內膜細胞培養液IL-1β、TNF-α的影響（±s）Tab.3 Effect of enema prescription for pelvic inflammatory disease on IL-1β and TNF-α concentration in endometrium cell culture fluid（±s）ng/L

表3 盆炎灌腸方對人子宮內膜細胞培養液IL-1β、TNF-α的影響（±s）Tab.3 Effect of enema prescription for pelvic inflammatory disease on IL-1β and TNF-α concentration in endometrium cell culture fluid（±s）ng/L

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與炎癥模型組比較，▲P＜0.05。

組別 IL-1β TNF-α正常對照組 604.97±11.00 75.44±13.88炎癥模型組 1292.26±7.99* 293.62±19.49*實驗組 672.00±10.27▲96.21±13.02▲

2.3.2 盆炎灌腸方對子宮內膜細胞炎癥模型IL-1β、TNF-α的mRNA表達的影響 半定量RT-PCR電泳灰度值比較可見，炎癥模型組細胞中IL-1β、TNF-α的mRNA表達水平明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；實驗組細胞中IL-1β、TNF-α的mRNA表達水平低于炎癥模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），且與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、表4。

圖2 各組目的基因擴增產物電泳圖Fig.2 Electrophoregram of target gene amplification product in each group

2.3.3 盆炎灌腸方對子宮內膜細胞炎癥模型NF-κB p65蛋白表達的影響 蛋白條帶灰度值比值比較，炎癥模型組細胞核中NF-κB p65蛋白的表達水平明顯高于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；實驗組細胞核中NF-κB p65蛋白的表達水平低于炎癥模型組，差異有統計學意義（P＜0.05），且與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3、表5。

表4 RT-PCR檢測IL-1β、TNF-α的mRNA表達量的灰度值統計學分析（±s）Tab.4 Statistic analysis of gray value of the expression of IL-1β,TNF-α mRNA for RT-PCR（±s）

表4 RT-PCR檢測IL-1β、TNF-α的mRNA表達量的灰度值統計學分析（±s）Tab.4 Statistic analysis of gray value of the expression of IL-1β,TNF-α mRNA for RT-PCR（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與炎癥模型組比較，#P＜0.05。

組別 IL-1β mRNA TNF-α mRNA正常對照組 0.530±0.0.15 0.472±0.018炎癥模型組 0.807±0.009* 0.745±0.017*實驗組 0.540±0.013#0.490±0.015#

圖3 Western blot法檢測盆炎灌腸方對子宮內膜細胞炎癥模型NF-κB p65蛋白的表達Fig.3 Effects of enema prescription for pelvic inflammatory disease on the expression of NF-κB p65 in inflammation model of endometrial cell

表5 NF-κB p65蛋白條帶灰度值分析結果（±s）Tab.5 Results of statistic analysis for gray value of NF-κB p65 protein stripe（±s）

表5 NF-κB p65蛋白條帶灰度值分析結果（±s）Tab.5 Results of statistic analysis for gray value of NF-κB p65 protein stripe（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與炎癥模型組比較，#P＜0.05。

組別正常對照組炎癥模型組實驗組NF-κB p65蛋白1.49±0.29 2.18±0.13* 1.23±0.01#

3 討論

目前對PID的研究，使用的實驗模型有動物模型、細胞模型。其中動物模型，在造模過程中其感染因素、致病菌、病理特點等都與人類PID相似，被廣泛使用，但由于種屬差異，其應用仍存在一定的局限性。本實驗以LPS作為刺激物誘導人子宮內膜細胞制作炎癥反應模型，將炎癥反應從體內移到體外，可以排除體內多種因素的干擾，能更好地反映炎癥發生時細胞產生的形態學變化及分子、基因水平上發生的變化[4]，為藥物作用實驗奠定了基礎。

盆炎灌腸方由紅藤、敗醬草、三棱、莪術、丹參、水紅花子、川楝子、延胡索組成。方中紅藤、敗醬草兩藥功善清熱解毒、祛瘀散結，均為治療腸癰腹痛的要藥，以除致病之因，共為君藥。三棱、莪術既入血分，又入氣分，兩者均善于行氣破血、消積止痛，為經典的活血祛瘀散結的藥對，兩藥配伍,破血逐瘀之力極佳，散一切血瘀氣結。再配合“功同四物”、活血化瘀、破血消積作用強的丹參，三者合用，共為臣藥，使瘀去而新生。川楝子善于行氣止痛，延胡索善于活血行氣止痛，兩者相須為用，使氣行血暢，疼痛自止。水紅花子功善化痞散結，清熱止痛，三藥并用，共為佐使藥，不僅助君藥、臣藥清熱、散結，且通暢氣機而止痛。綜觀全方，融清熱利濕、活血化瘀法于其中，選藥得當，為治療盆腔炎性疾病的良方。

現代藥理研究證實，盆炎灌腸方中的多味中藥具有抗炎作用。Rmoker等[5]發現紅藤莖藤煎液對金黃色葡萄球菌、乙型鏈球菌等有較強的抑制作用；敗醬草制劑在治療婦科炎癥（陰道炎、宮頸炎、慢性盆腔炎及宮頸糜爛等）方面具有一定療效[6]。丹參中的丹參酮通過抑制炎性細胞因子的表達從而減輕炎癥反應[7]。水紅花子水煎劑對志賀氏痢疾桿菌和福氏痢疾桿菌具有抑制作用[8]。鄭蓓蓓等[9]研究表明,川楝子、延胡索有明顯的抗炎作用,其抗炎作用機制部分在于抑制前列腺素E2（PGE2）、一氧化氮（NO）、白介素-6（IL-6）的產生，抑制PMN產生氧自由基。

在炎癥反應復雜的網絡系統中，內皮細胞、單核細胞受到刺激后活化，分泌出多種細胞因子和炎性介質，繼而激活一些炎性細胞的NF-κB，促使單核細胞不斷分泌IL-1、TNF-α等細胞因子，從而導致炎癥反應的擴大。細胞因子已被證實與急慢性炎癥疼痛的產生密切相關[10]。IL-1β和TNF-α都是激活免疫和炎性細胞重要的促炎性細胞因子，在炎癥反應過程中起促進作用，通過免疫上調和促進炎癥介質的活性而加重子宮內膜的炎癥反應和組織損傷。IL-1既是機體組織受到損傷和發生炎癥反應時作出急性反應的關鍵介質[11]，又是啟動抗菌炎性反應的關鍵細胞因子之一[12]。TNF-α既是啟動炎癥的重要細胞因子，還與腹膜粘連的形成有著顯著性聯系，是腹膜粘連形成的可靠的生物學標志[13]，可刺激成纖維細胞增殖ECM增多，同時通過細胞因子調節網絡的協同作用參與促進纖維化[14]。

NF-κB是一種多效性轉錄因子，作為信號傳導途徑的樞紐，與炎癥、免疫、腫瘤的發生發展、細胞調亡的調節等有密切聯系，具有多種調節作用，可以與多種基啟動子部位κB位點發生特異性的結合從而促進其轉錄表達，在炎癥反應的細胞因子網絡調控中起重要作用。據研究報道[15]，在呼吸道、腸道炎癥發生時，LPS和白細胞呼吸暴發過程產生的活性氧均可通過激活腺上皮細胞NF-κB引起IL-1β、TNF-α轉錄增多,二者又是NF-κB的激活劑，從而引起中性粒細胞、淋巴細胞NF-κB激活,通過TNF-α、IL-1β正反饋作用,NF-κB的激活進一步增加,形成級聯反應，從而使炎癥反應放大及延續。

本研究表明，子宮內膜細胞炎癥模型中TNF-α和IL-lβ的含量上升，IL－1β、TNF-α mRNA及NF-кB p65的表達也明顯增加，NF-κB信號通路被激活，促進了炎性介質的釋放，促使IL-1β、TNF-α轉錄增多，NF-кB p65與趨化性細胞因子具有雙重性，一方面,趨化白細胞到達炎癥部位,加強白細胞對病原菌的殺滅；另一方面,大量的趨化性細胞因子則導致過度的炎癥反應,造成組織損傷，兩者增多同時可以激活NF-κB，形成級聯反應,從而使子宮內膜炎癥反應放大、延續。盆炎灌腸方可抑制NF-кB p65的表達，從而阻斷NF-κB信號通路活化，使子宮內膜細胞炎癥模型中的IL-1β、TNF-α mRNA的表達水平明顯下降，與正常子宮內膜細胞中IL-1β、TNF-α mRNA表達水平基本均等，由此推測盆炎灌腸方降低了細胞中IL-1β、TNF-α mRNA的轉錄,減少了對NF-κB的進一步活化,從而使受NF-κB調控的炎癥介質IL-1β、TNF-α產生減少,減輕細胞壞死以及細胞壞死所致鄰近組織繼發性損傷，發揮其抗炎作用治療PID后遺癥。

本研究中采用盆炎灌腸方培養液直接作用于子宮內膜細胞，可以直接檢測藥物對機體局部功能指標,能夠反映藥物中在可吸收部位的直接作用，且操作簡單易行，但還存在局限性，未能體現中藥灌腸給藥途徑的意義，筆者會在今后繼續研究。

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Experimental study on anti-inflammatory effects of enema prescription for pelvic inflammatory disease in inflammatory model of endometrium cell

ZHAO Lin,WANG Ya-nan,SONG Dian-rong
（Department of Gynecology,The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300150,China）

[Objective]To study the anti-inflammatory effects of enema prescription for pelvic inflammatory disease in an inflammatory model of endometrium cell.[Methods]The model of inflammatory endometrium cell was established by inducing endometrium cell with lipopoly-sacharide.They were randomly divided into three groups:normal cell control,inflammatory model and experimental group.After culture for 72 hours,the concentration of IL-1β and TNF-α,their expression of mRNA and the protein expression of NF-κB p65 were detected.[Results]The enema prescription for pelvic inflammatory disease can effectively inhibit the secretion of IL-1β,TNF-α and the expression of their mRNA in the model group.It can also effectively inhibit the expression level of NF-κB p65 in the cellular nucleus of model group.[Conclusion]The enema prescription of pelvic inflammation has obviously anti-inflammatory effect in the model of pelvic inflammatory disease and it may be related to NF-κB pathway.

enema prescription for pelvic inflammatory disease;endometrium cell;inflammation model;IL-1β;TNF-α;NF-κB

R285.5

A

1672-1519（2014）11-0681-05

2014-05-18）

（本文編輯：馬 英，馬曉輝）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.11.12

天津市中醫藥管理局中醫、中西醫結合科研基金項目（11056）。

趙 琳（1987-），女，碩士研究生，住院醫師，主要研究方向為中醫婦科學。

宋殿榮，E-mail:songdr58@126.com