針刺治療慢性應(yīng)激抑郁型大鼠的機(jī)制研究

劉明菲，燕 平，喬瑞瑞，金曉飛，王海軍，閆麗萍

(山西中醫(yī)學(xué)院，山西太原 030024)

當(dāng)今社會(huì)在“快餐式”的飛速發(fā)展中，競(jìng)爭(zhēng)壓力越來越大，抑郁癥的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，抑郁癥以興致低落和自我體驗(yàn)為核心癥狀［1］。目前抑郁癥機(jī)制尚不明確，眾說紛紜，廣為大家所探討的機(jī)制其一是下丘腦—垂體—腎上腺軸(HPA軸)［2～4］功能失調(diào)的研究，其二是有關(guān)細(xì)胞外信號(hào)通路系統(tǒng)(ERK通路)功能失調(diào)的探討［5］。結(jié)合之前所研究的針灸治療抑郁癥最佳組方，本文旨以此為基礎(chǔ)，針對(duì)以上兩個(gè)機(jī)制研究，討論針灸治療抑郁癥最佳組方對(duì)慢性應(yīng)激抑郁型大鼠的治療機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD雄性大鼠30只，體重(250±20)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑與儀器

ERK1免疫組化試劑盒購自山西吉泰和寧科技有限公司。FA-1004型精密電子天平，上海天平儀器廠。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組

將30只大鼠隨機(jī)分為3組。分別為空白組(n=10)，模型組(n=10)和針刺治療“解郁方”組(百會(huì)+神門+太沖)。

2.2 模型制備

采用李藝等［6］、王雀良等［7］實(shí)驗(yàn)造模方法并加以改良。本實(shí)驗(yàn)采用21 d不同刺激。應(yīng)激源包括:冷水游泳(4 ℃，5 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)、晝夜顛倒(24 h)、熱烘(45℃，5 min)、束縛 (3 h)，夾尾(3 min)。以7 d為1個(gè)周期，每天隨機(jī)安排其中1種，單籠飼養(yǎng)。

2.3 針刺處理

造模開始后就對(duì)針刺治療組進(jìn)行治療。選用華佗牌15 mm針灸針進(jìn)行針刺，連接到SDZⅡ型HANS電刺激儀。電針頻率為2 Hz，刺激強(qiáng)度不超過2 mA［8］，共電針20 min。每日1次，于應(yīng)激造模前1 h針刺，連續(xù)治療3周。模型組抓取、固定，但不做針刺，其他處理同針刺組。空白組群養(yǎng)不予任何處理。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 腎上腺指數(shù) 大鼠按劑量10 g/L腹腔注射20%的烏拉坦，麻醉后斷頭，手術(shù)剪解剖腹腔，完整取出腎上腺，用眼科鑷剔除結(jié)締組織和脂肪，用1 mL注射器抽取9%氯化鈉注射液1 mL，將腎上腺殘留的血水沖凈，用定性濾紙將其吸干后，稱取腎上腺質(zhì)量，計(jì)算腎上腺指數(shù)。計(jì)算公式為:腺體指數(shù)=腺體質(zhì)量(mg)/體重(100g)。

2.4.2 ERK1免疫組化陽性細(xì)胞計(jì)數(shù) 方法同上，斷頭后，為方便解剖，冰上頭顱，迅速游離左側(cè)完整海馬組織，取出左側(cè)海馬組織，標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，切片以海馬為中心做冠狀面切片，厚度50 μm。免疫組化SABC法染色。

2.4.3 SABC法染色 將切片置于切片架上，于60℃恒溫烤箱中烤1 h;切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3次，10 min/次;切片經(jīng)下行酒精水化，無水乙醇5 min，95% 乙醇 2 次(2 min/次)，85% 乙醇2 min，75%乙醇2 min，自來水沖洗 3次，雙氧水洗 2次(2 min/次);水浴鍋加熱切片至100℃，室溫自然冷卻，自來水沖洗，雙氧水及 TBS分別洗滌 2次(2 min/次);滴加封閉緩沖液，ERK1一抗孵育切片，TBS洗滌，滴加封閉緩沖液，37℃濕盒孵育10 min;30 min濕盒孵育生物素化羊抗兔IgG(1∶400);TBS洗滌，Tween 20封閉20 min，室溫下孵育HRP-SA復(fù)合物(1∶150)，TBS洗滌5 min，2次，DAB 顯色液加強(qiáng)染色;脫水、透明、封片，陰性對(duì)照用PBS替代一抗。光鏡下觀察并照相。

2.5 結(jié)果判定

ERK1陽性定位于細(xì)胞質(zhì)，利用Image Pro Plus6.0多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)，每張切片(200倍光鏡下)選擇4個(gè)不重疊的視野，圖像分析軟件進(jìn)行圖像采集和處理，選取海馬兩側(cè)齒狀回部位，ERK1陽性染色定位于細(xì)胞胞漿，用單位面積陽性細(xì)胞記數(shù)和總細(xì)胞數(shù)的百分比表示該成分的相對(duì)含量，取其平均值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)后的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 腎上腺指數(shù)

對(duì)抑郁模型大鼠腺體重量的影響，與空白組大鼠相比，均出現(xiàn)了顯著性變化(P＜0.05)，模型組及治療組均出現(xiàn)腎上腺指數(shù)升高。與模型組相比，治療組與其存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。結(jié)果提示針刺“解郁方”治療組對(duì)抑郁模型所致腎上腺指數(shù)的上升具有一定的抑制作用(見表1)。

4.2 ERK1陽性細(xì)胞相對(duì)含量

空白組的ERK1陽性神經(jīng)元數(shù)目的相對(duì)含量較治療組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，較模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。模型組的ERK1陽性神經(jīng)元數(shù)目的相對(duì)含量較治療組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。空白對(duì)照為陰性反應(yīng)。結(jié)果提示抑郁癥能抑制ERK通路調(diào)節(jié)，針刺治療抑郁癥能有效興奮其通路恢復(fù)正常(見表2)。光鏡下可見ERK1免疫組織化學(xué)的陽性細(xì)胞位于海馬區(qū)，主要集中于CA1、CA3區(qū)錐體細(xì)胞，其陽性反應(yīng)存在于細(xì)胞胞漿中，細(xì)胞胞核不染色(見圖1)。

表1 針刺對(duì)各組大鼠腺體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of the Rats＇Adrenal Mass in Acupuncture Groups

表2 各組大鼠海馬ERK1相對(duì)含量比較 個(gè)/HPTable 2 Comparison of Relative Contents of Erk1 in Each Groups one/HP

圖1 各組海馬齒狀回ERK1的表達(dá)，免疫組化SABC法Fig 1 Expression of Hippocampal Pentate Gyrus ERK1and Immunolistochemical SABC Method

5 討論

抑郁癥的生理病理機(jī)制十分復(fù)雜。目前認(rèn)為，抑郁癥是由多種因素相互作用的結(jié)果，本文就該問題進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以探尋針刺治療抑郁癥機(jī)制，通過腺體質(zhì)量研究其與下丘腦—垂體—腎上腺(HPA)軸的關(guān)聯(lián)，通過海馬組織ERK1的陽性細(xì)胞相對(duì)含量發(fā)現(xiàn)針刺治療抑郁癥與ERK通路關(guān)系。

Amsterdam等［9］文獻(xiàn)研究表明，與非抑郁人群相比，抑郁癥患者的腎上腺形態(tài)增大;HPA軸功能活躍，內(nèi)源性ACTH的慢性刺激導(dǎo)致腎上腺肥大。本文結(jié)果提示抑郁型大鼠腎上腺增重、肥大，雖尚不能達(dá)到正常大鼠水平，但模型組大鼠腎上腺質(zhì)量有所改觀。

海馬是邊緣系統(tǒng)重要組成部分之一，參與情緒、記憶和學(xué)習(xí)、免疫、行為等的調(diào)節(jié)，它的損傷在各種應(yīng)激所致疾患中起至關(guān)重要的作用。因此，在抑郁癥的機(jī)制研究中，探討應(yīng)激對(duì)海馬的影響是極為重要的。應(yīng)激能破壞神經(jīng)元損傷與再生之間的平衡，顆粒細(xì)胞減少，CA3錐形神經(jīng)元萎縮及數(shù)目的減少，海馬體積下降，功能受損，最終出現(xiàn)抑郁癥的臨床變現(xiàn)。ERK是一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，調(diào)控基因表達(dá)。ERK1可誘發(fā)腦內(nèi)神經(jīng)元的快速變化，慢性應(yīng)激可以一定程度上引起大鼠腦內(nèi)ERK通路表達(dá)抑制，而電針可以改善其抑制作用。電針可活化ERK通路上的關(guān)鍵指標(biāo)ERK，故而對(duì)下游產(chǎn)生影響而發(fā)揮抗凋亡和抗抑郁的作用。本文研究ERK蛋白相對(duì)含量提示，電針能有效改善神經(jīng)元凋亡、萎縮等現(xiàn)象，其效果基本達(dá)到正常大鼠水平，因此針刺能有效改善其功能，更對(duì)ERK通路有活躍功能。

［1］ 龔紹麟.抑郁癥［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003.

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