全自動血細胞分析儀稀釋模式用于腦脊液細胞計數及分類檢測的可能性

侯辰蕊，劉敏麗，李 紅

(山西大醫院，山西 太原 030032)

腦脊液常規檢測目前多采用手工操作，不同操作者的熟練程度、主觀判斷不一致，特別是腦脊液細胞計數和分類長期以來一直存在結果重復性差、耗時長等問題。因此，目前臨床上采用自動化程度高、檢驗結果客觀準確的全自動血細胞分析儀替代手工操作應用于腦脊液細胞計數和分類分析，全自動血細胞分析儀ABX PENTRA 60采用半導體激光流式結合核酸熒光染色以及鞘流電阻抗原理。本資料采用ABX PENTRA 60血細胞分析儀的稀釋模式對腦脊液進行細胞計數分類，并與傳統手工計數法進行比較，進一步探討ABX PENTRA 60血細胞分析儀應用于腦脊液細胞計數、分類的可能性及效果。

1 材料和方法

1.1 材料

標本來源于2013年3月至8月山西大醫院住院患者腦脊液標本100份。

1.2 儀器與試劑

采用日本ABX PENTRA 60自動血細胞分析儀及配套質控品、試劑，日本Olympus光學顯微鏡，上海無光公司改良牛鮑氏計數板。

1.3 方法

1.3.1 手工計數方法 按照第3版全國臨床檢驗操作規程中腦脊液檢驗方法采用改良牛鮑氏計數盤進行操作。全部標本均由兩名工作經驗豐富的主管技師計數分類，結果取平均值。

1.3.2 全自動血細胞分析儀檢測 按ABX PENTRA 60全自動血細胞分析儀標準操作規程的稀釋模式對腦脊液標本進行測定。

1.3.3 相關性分析 比較ABX PENTRA 60全自動血細胞分析儀和手工計數法(顯微鏡法)的白細胞計數、紅細胞計數、單個核細胞絕對計數、多個核細胞絕對計數的結果，并進行相關性分析。

1.3.4 標本穩定性觀察 將10份腦脊液在室溫中分別放置1、2、3、4 h，然后用 ABX PENTRA 60 全自動血細胞分析儀檢測，觀察白細胞、紅細胞計數及白細胞分類指標有無變化:

1.3.5 重復性觀察 使用XT-4000i自動血細胞分析儀，對細胞密度不同的5份腦脊液標本(高、中、低三個密度)分別進行5次連續測定，求出平均值和變異系數(CV%)。

1.4 統計學處理

采用SPSS12.0軟件對數據進行配對t檢驗和直線相關性分析及線性回歸分析。

2 結果

2.1 相關性

分別用手工計數法和ABX PENTRA 60全自動血細胞分析儀稀釋模式兩種方法對100份腦脊液標本進行白細胞計數、紅細胞計數、單個核細胞絕對計數及多個核細胞絕對計數，結果經統計學處理差異無統計學意義(P＞0.05)，兩者呈現良好的相關性(白細胞計數r=0.988，紅細胞計數r=0.988，單個核細胞絕對計數r=0.953，多個核細胞絕對計數r=0.981)見圖1。

圖1 儀器與手工計數的相關性Fig 1 Relevance between Instrument and Manual Counting

2.2 穩定性

將10份不同細胞密度的腦脊液分別置于室溫下放置1、2、3、4 h，用 ABX PENTRA 60 全自動血細胞分析儀測定，觀察白細胞計數、紅細胞計數及分類指標的變化，應用線性回歸分析結果得出腦脊液中白細胞計數、紅細胞計數及白細胞分類在4 h內偏倚值均無統計學意義(P＞0.05)，但單個核細胞(主要為淋巴細胞)百分比隨著時間的延長而降低，多個核細胞(主要為中性粒細胞)百分比隨著時間的延長而升高。因此對于腦脊液標本要及時檢測，以免結果不準確。見表1～4。

表1 ABX PENTRA 60全自動血細胞分析儀白細胞計數 個/μLTable 1 WBC Counts of ABX PENTRA 60 Automatic Blood Cell Analyzer unit/μL

表2 ABX PENTRA 60全自動血細胞分析儀紅細胞計數 個/μLTable 2 RBC Counts of ABX PENTRA 60 Automatic Blood Cell Analyzer unit/μL

表3 ABX PENTRA 60全自動血細胞分析儀單個核細胞百分比 %Table 3 Mononuclear Cell Percentage of ABX PENTRA 60 Automatic Blood Cell Analyzer %

表4 ABX PENTRA 60全自動血細胞分析儀多個核細胞百分比 %Table 4 Multinuclear Cell Percentage of ABX PENTRA 60 Automatic Blood Cell Analyzer %

2.3 重復性

將白細胞計數分別為456.2 個/μL、89.4 個/μL、6.9個/μL的3份腦脊液標本分別連續測定10次，ABX PENTRA 60全自動血細胞分析儀檢測結果顯示CV值分別為3.1%、4.3%、9.7%，雖然低細胞密度標本CV值上升，但明顯低于手工操作的CV值(手工法一般＞20%)，表明自動血細胞分析儀檢測重復性良好，精密度明顯提高。

3 討論

腦脊液的細胞學分析可以為臨床提供有價值的診斷依據。當成人腦脊液中單個核細胞計數＞5個/μL或新生兒腦脊液中單個核細胞計數＞30個/μL時，可輔助診斷腦膜炎、腦炎、白血病浸潤等中樞神經系統疾病［1］。腦脊液白細胞計數也可以用于監視白血病或淋巴瘤的治療效果。正常腦脊液中無紅細胞，當腦脊液中紅細胞計數升高時提示腦出血或脊椎穿刺外傷［2］。目前臨床實驗室仍普遍應用手工計數板進行腦脊液常規檢查，不同操作者之間由于熟練程度、規范程度不同，結果具有很大誤差，且結果回報時間長，難以滿足臨床科室需求。腦脊液常規檢測中的白細胞計數，紅細胞計數及白細胞分類常用手工方法。腦脊液手工計數方法有檢測周期長(通常需要30～45 min)、主觀差異大等缺陷。與血液和尿液相比，腦脊液樣本量少。手工計數所取標本充池量為1 μL，由于取樣量少而不能保證計數的精確度。國內外已有許多文獻探討流式細胞術應用于腦脊液細胞計數［3］。另外，白細胞分類計數是腦脊液常規的一個關鍵組成部分，這對于中樞神經系統疾病特別是腦膜炎的臨床鑒別診斷作用非常重要。病毒性腦膜炎腦脊液白細胞分類的特點是單個核細胞(淋巴細胞)占多數。而細菌性腦膜炎是以分葉核細胞(粒細胞)為主［4］。

本研究中，通過比較100例腦脊液常規標本，得出手工計數與儀器對比結果為相關性好。白細胞計數范圍是0～290個/μL，相關系數為0.988。儀器 WBC 平均值為55個/μL，手工計數 WBC 平均值為56個/μL。RBC 計數范圍是0～190個/μL，相關系數為0.988，儀器RBC平均值為135個/μL，手工計數RBC平均值為139個/μL。回歸分析結果經過配對t檢驗得出，應用儀器進行白細胞計數、紅細胞計數及白細胞分類與手工方法有大于95%的相關性。稀釋測定模式，實際是吸取標本之后進行了自動稀釋，相當于將腦脊液標本濃縮50倍，因此可以得到較理想的結果。用ABX PENTRA 60全自動血細胞分析儀進行腦脊液細胞計數與顯微鏡手工計數相比具有更好的準確性與精密度，線性范圍廣，需要標本量少，檢測時間短(報告時間為2 min，而手工操作至少需要30 min)，避免了手工操作中間環節，減少誤差，大大提高了檢測的準確性。標本的穩定性是腦脊液常規檢測的關鍵所在。比較儀器測定采集標本后室溫下放置1、2、3、4 h的計數值，應用配對t檢驗，統計顯示無顯著差異。本資料對高、中、低三個密度腦脊液標本進行重復性實驗，表明ABX PENTRA 60全自動血細胞分析儀檢測重復性良好，精密度明顯提高。用儀器測定的優勢還包括用質控品來保證測定結果的準確性。

本研究結果表明ABX PENTRA 60全自動血細胞分析儀在腦脊液細胞計數方面，完全可以代替傳統經典方法顯微鏡手工計數。但儀器法細胞分類檢測仍為篩選檢查，特別是出現異常細胞團時，必須進行顯微鏡涂片染色檢查，仔細查找是否為腫瘤細胞，以確認標本中有無腫瘤細胞存在。值得注意的是臨床標本最好進行EDTA抗凝，避免標本有凝塊造成的結果不準確。ABX PENTRA 60全自動血細胞分析儀在實際工作中有廣闊的應用前景。

［1］ Andrews J，Setran E，McDonnel L，et al.An Evaluation of the Celldyn 3200 for Counting Cells in Cerebrospinal and Oyher Body Fluids［J］.Lab Hematol，2005，11:98-106.

［2］ 譚曉玉，王霞莉，王紀敏.流式細胞技術用于腦脊液細胞分析方法學研究［J］.醫學檢驗與臨床，2008，19(4):18-19.

［3］ Hoffman JJML，Janssen WCM.Automated Counting of Cells in Cerebrospinal Fluid Using the CellDyn-4000 Hematology Analyser［J］.Clin Chem Lab Med，2002，40:1168-1173.

［4］ Van Acker JT，Delanghe R，Langlois MR，et al.Automated Flow Cytometric Analysis of Cerebrospinal Fluid［J］.Clin Chem，2001，47:556-560.

［5］ 葉應嫵，申子瑜.全國臨床檢驗操作規程［M］.3版.南京:東南大學出版社，2012.