ETA受體拮抗劑對急性肺栓塞大鼠的保護作用

李 捷，董華進

1解放軍總醫院 胸外科，北京 100853；2軍事醫學科學院毒物藥物研究所，北京 100850

基礎研究

ETA受體拮抗劑對急性肺栓塞大鼠的保護作用

李 捷1，董華進2

1解放軍總醫院 胸外科，北京 100853；2軍事醫學科學院毒物藥物研究所，北京 100850

目的 探討ETA受體拮抗劑安貝生坦對急性肺動脈栓塞大鼠的保護作用。方法60只SD大鼠中隨機取10只作為對照組；另50只隨機分為兩組，模型組(25只)給予0.9%氯化鈉注射液灌胃，安貝生坦組(25只)給予40 mg/kg的安貝生坦灌胃。30 min后，分別自兩組大鼠尾靜脈注射膠原+腎上腺素，制備急性肺栓塞模型。觀察急性肺栓塞大鼠的死亡率。對未猝死大鼠繼續給藥，1次/d，連續1周，用多導生理記錄儀記錄未猝死大鼠及對照組大鼠的右心室收縮壓、右心指數、平均肺動脈壓的變化，用RT-PCR法測定右心室肌的心鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)mRNA的表達，比較安貝生坦組、模型組和對照組之間的差異。結果急性肺栓塞大鼠安貝生坦組的死亡率低于模型組(P＜0.05)；未猝死大鼠繼續用藥1周后，安貝生坦組右心室收縮壓及平均肺動脈壓低于模型組(P＜0.05)，但仍高于對照組(P＜0.05)；安貝生坦組大鼠的右心指數、心肌ANP mRNA的表達低于模型組(P＜0.05)。結論ETA受體拮抗劑安貝生坦可降低急性肺栓塞大鼠的死亡率，緩解繼發的肺動脈高壓，改善右心室功能。

急性肺栓塞；大鼠；安貝生坦

急性肺動脈栓塞(acute pulmonary embolism，PTE)是一種十分兇險的疾病，其發病率已躍居心血管疾病發病率的第3位，PTE發病后引起廣泛的多系統功能損害，病死率極高，90%的死亡發生于起病后1 h內，由于其致猝死的機制復雜，目前尚無有效的救治措施[1-3]。近年來，急性肺栓塞已為我國常見疾病，每年有29萬余患者因急性肺栓塞死亡，國內漏診率和誤診率高達67%，來不及治療的肺栓塞患者病死率可達25% ～ 30%[4]。臨床已經證實，急性肺栓塞發生時，肺組織中縮血管因子內皮素ET-1含量顯著升高，并在肺動脈高壓的形成中起至關重要的作用[5]。安貝生坦是一種高選擇性ETA拮抗劑，可以阻斷ET與ETA受體的結合，并對急性肺栓塞小鼠有保護作用，能延長栓塞后小鼠的存活時間[6]。本研究擬在臨床及對肺動脈栓塞小鼠的研究基礎上，分析ETA受體拮抗劑安貝生坦對急性肺栓塞大鼠血流動力學的保護作用。

材料和方法

1 實驗材料 選取60只雄性SD大鼠，3 ～ 4周齡，體質量200 ～ 240 g，平均體質量(223.6±9.4) g，由斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司提供，動物合格證號：SCXK(京)2011-0004。藥品：安貝生坦(購于Sigma公司)；膠原(美國Chrono-log公司)；腎上腺素。

2 動物分組及模型制備 從60只大鼠中隨機取10只作為對照組，剩余50只隨機分為兩組，一組給予0.9%氯化鈉注射液灌胃(模型組，25只)，另一組給予40 mg/kg的安貝生坦灌胃(安貝生坦組，25只)。30 min以后，用尾靜脈注射膠原+腎上腺素混合液(膠原1.25 mg/kg+腎上腺素0.05 mg/kg)的方法制備急性肺栓塞模型[7]。以60 min為時間截點統計大鼠的死亡率，對未猝死大鼠繼續給藥，1次/d，連續用藥1周后(模型組用0.9%氯化鈉注射液灌胃，安貝生坦組用40 mg/kg的安貝生坦灌胃)，用多導生理記錄儀記錄未猝死大鼠及對照組大鼠的右心室收縮壓、右心指數、平均肺動脈壓的變化，用RT-PCR法測定右心室肌的心鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)mRNA的表達，比較安貝生坦組、模型組和對照組之間的差異[8]。

3 行右心導管法測右心室收縮壓及平均肺動脈血壓[9]腹腔注射烏拉坦麻醉大鼠(25%，0.5 ml/100 g)后，分離氣管，行氣管插管，分離頸外靜脈，遠心端結扎，近心端用動脈夾夾閉，將導管插入并慢慢推進，導管經右心房、右心室到達肺動脈，連接壓力換能器。用MedLab生物信號采集系統記錄右心室壓力、肺動脈血壓的變化。實驗結束后，過量麻醉大鼠致安樂死。右心室壓力及肺動脈血壓的抑制率由以下公式得出：

抑制率(%)=100×(模型組壓力－安貝生坦組壓力)/(模型組壓力－對照組壓力)。

4 右心指數測定 測定壓力結束后，取出大鼠心臟，分離右心室自由壁、左心室及室間隔，用濾紙吸干，萬分之一級分析天平稱重。右心指數=右心室自由壁(RV)重/左心室及室間隔(LV+S)重，確定大鼠右心肌肥厚程度。

5 RT-PCR法檢測心肌組織ANP mRNA的表達

取心肌組織加入適量Trizol試劑勻漿、裂解，取1 ml裂解液，氯仿抽提，異丙醇沉淀，回收總RNA，貯存于-70℃待用。以1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計A260/A280鑒定RNA純度和濃度。取約1 μg總RNA，進行反轉錄。反轉錄條件為：42℃ 60 min，99℃ 2 min，4℃保存。ANP的引物序列(5'-3')為GGCTCCTTCTCCATCACCAATGTT ATCTTCGGTACCG，內參GAPDH的引物序列(5'-3')為CAAAGTTGTCATGGATGACCATGGAGAAGGC TGGG[10]。上述引物由北京奧科生物有限公司合成，滅菌水溶解并配制成100 μmol/L的上下游引物混合液，使用濃度為20 μmol/L。PCR反應條件：預變性94℃ 4 min，變性94℃ 45 s，退火60℃ 45 s，延伸72℃ 45 s，終末延伸72℃ 5 min，4℃終止，20個循環。循環擴增結束后，取6 μl產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結束后，置于凝膠成像系統進行觀察和分析。

6 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行統計學處理，計量資料用表示，組間比較用單因素方差分析結合Student-Newman-Keuls t檢驗；計數資料用頻數或百分率表示，組間比較用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 肺動脈栓塞模型的制備 用尾靜脈注射膠原+腎上腺素混合液(膠原1.25 mg/kg+腎上腺素0.05 mg/kg)的方法制備肺動脈栓塞模型，給藥10 ～ 15 min后，大鼠便出現明顯顫動、呼吸加快、發紺等癥狀，表明模型制備成功[2]。

2 模型組與安貝生坦組大鼠死亡率比較 模型組大鼠的死亡率為76%(19/25)，安貝生坦組大鼠的死亡率為52%(13/25)，安貝生坦組大鼠的死亡率低于模型組(P＜0.05)，表明安貝生坦能夠降低急性肺栓塞大鼠的死亡率。

3 安貝生坦對大鼠血流動力學的影響 對未猝死大鼠繼續給藥，1次/d，連續用藥1周后，模型組大鼠右心室收縮壓、平均肺動脈壓和右心指數升高，與對照組比較有統計學差異(P＜0.01)，說明急性肺栓塞引起大鼠繼發性肺循環血流動力學改變；安貝生坦組右心室收縮壓、平均肺動脈壓和右心指數均低于模型組，與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)，但仍然均高于對照組(P＜0.05)，表明安貝生坦在一定程度上改善急性肺栓塞大鼠繼發性肺循環血流動力學變化。具體數據見表1。

表1 安貝生坦對未猝死急性肺栓塞大鼠肺循環血流動力學的影響Tab. 1 Effect of ambrisentan on pulmonary circulation hemodynamics in APC rats (-x±s)

4 安貝生坦對大鼠右心室心肌組織ANP mRNA表達量的影響 對未猝死大鼠繼續給藥，1次/d，連續用藥1周后，模型組大鼠右心室心肌組織ANP的表達較對照組顯著升高(P＜0.05)，安貝生坦組右心室心肌組織ANP mRNA的表達顯著降低，與模型組比較有統計學差異(P＜0.05)，與對照組比較無統計學差異；提示ETA受體拮抗劑安貝生坦可改善急性肺栓塞引起的心肌細胞肥大。見圖1。

圖 1 安貝生坦對未猝死急性肺栓塞大鼠右心室心肌組織ANP mRNA表達的影響Fig. 1 Effect of ambrisentan on ANP mRNA expression in myocardium of survived APC rats (bP＜0.05, vs model group)

討 論

研究報道，血管相關性因子在急性肺動脈栓塞動物的病理改變中起重要作用[11]。內皮素(ET-1)是重要的血管收縮因子，具有強烈的收縮血管的作用，是迄今為止發現的最強縮血管因子，ET-1濃度的增高可引起肺血管和支氣管痙攣并增加毛細血管通透性，它能激活位于肺血管平滑肌的ET受體，增高血管張力，增加細胞內Ca2+濃度，并促使細胞外Ca2+內流等[5]。健康人血液中ET-1的含量為0.6% ～ 0.7%，文獻報道在急性肺動脈栓塞后24 h，血漿ET-1的含量升高很快，甚至在栓塞后2周含量仍然很高，其拮抗劑能有效地降低栓塞引起的肺動脈高壓[12]。我們之前的研究提示，安貝生坦能延長急性肺動脈栓塞小鼠的存活時間，減輕肺水腫，對肺栓塞小鼠起到一定的保護作用[6]。在對肺動脈栓塞小鼠的研究基礎上，進一步探討ETA受體拮抗劑安貝生坦對急性肺栓塞大鼠血流動力學的保護作用。

實驗結果顯示：1)肺動脈栓塞60 min時，安貝生坦組大鼠的死亡率(52%)明顯低于模型組(76%)；2)對未猝死肺栓塞大鼠用安貝生坦繼續進行干預1周后，其血流動力學發生了變化。對照組右心室收縮壓為(26.1±4.6) mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，而模型組高達(58.1±9.3) mmHg，是前者的2倍，安貝生坦(40 mg/kg)組為(46.3±8.6) mmHg，抑制率為36.9%；3)對照組平均肺動脈壓為(14.8±0.9) mmHg，模型組升高至(25.3±2.1) mmHg，安貝生坦(40 mg/kg)組為(21.9±2.7) mmHg，抑制率為32.3%；4)對照組的右心指數為0.263±0.026；1周后，模型組大鼠右心指數達到0.425±0.028，安貝生坦(40 mg/kg)組右心指數降至0.386±0.037；5)模型組心肌組織ANP的表達較對照組升高，安貝生坦組心肌組織ANP mRNA的表達較模型組降低，ANP的表達量增加又是心肌細胞肥大的標志性變化。分析以上結果，提示ETA受體拮抗劑安貝生坦可改善急性肺栓塞引起的右心室收縮壓、肺動脈高壓等血流動力學指標，有減輕右心室心肌損傷、改善右心室肥厚的作用。以上這些血流動力學指標的變化是臨床預后的理論基礎，是探討PTE血流動力學變化的簡便、實用、直觀的方法[13]。國際上，右心室功能不全已列為急性肺栓塞風險分級的主要指標來預估肺栓塞患者的早期死亡率[3]。右心室肥厚如不及時干預，可導致心力衰竭[14]。

綜上所述，安貝生坦作為一種高效的ETA受體拮抗劑，能改善急性肺栓塞模型的血流動力學，減輕心室肌細胞的損傷，藥物作用值得肯定。關于ETA受體拮抗劑安貝生坦在抑制肺栓塞發病機制中的其他作用，尚需進一步探討。

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Role of ETA-receptor antagonist in protecting rats against acute pulmonary embolism

LI Jie1, DONG Hua-jin2
1Department of Thoracic Surgery, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Military Medical Science, Beijing 100850, China
The frst author: LI Jie. Email：ljpla301@163.com

ObjectiveTo study the role of ETA-receptor antagonist, ambrisentan in protecting rats against acute pulmonary embolism (APE).MethodsSixty SD rats were randomly divided into normal control group (n=10), model group (n=25), ambrisentan treatment group (n=25). Thirty minutes after the rats in model group received intragastric injection of 0.9% normal saline and those in ambrisentan treatment group received intragastric injection of ambrisentan (40 mg/kg), an APE model was established by injecting collagen + epinephrine via the tail vein to observe the mortality of rats. The right ventricular systolic pressure, right ventricular index and mean pulmonary artery pressure were recorded using a multichannel physiology recorder, the expression of atrial natriuretic peptide (ANP) mRNA in right ventricular muscle was detected by RT-PCR, and the difference in 3 groups was compared after the survived rats were given drugs, once a day for 1 week.ResultsThe mortality was obviously lower in ambrisentan treatment group than in model group (P＜0.05). The right ventricular systolic pressure and mean pulmonary artery pressure were signifcantly lower in the survived rats of ambrisentan treatment group than in those of model group 1 week after drug treatment and signifcantly higher than in control group (P＜0.05). Ambrisentan inhibited the expression of ANP mRNA in myocardium (P＜0.05) and the right ventricular index was lower in Ambrisentan group than in model group (P＜0.05).ConclusionAmbrisentan, an ETA-receptor antagonist, can decrease the mortality of APC rats, relieve their secondary pulmonary arterial hypertension and improve their right ventricular function.

acute pulmonary embolism; rats; ambrisentan

R 563.5

A

2095-5227(2014)07-0718-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.07.020

時間：2014-03-20 08:37

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140320.0837.001.html

2013-11-08

國家高技術研究發展計劃(863)(2006AA020601)

Supported by the National High Technology Research and Development Program of China(2006AA020601)

李捷，男，博士，副主任醫師。研究方向：肺動脈栓塞、肺部腫瘤的診斷及外科治療。Email：lipla301@163.com