乳鼠胰腺間質細胞培養上清對骨髓間充質干細胞分裂增殖的抑制作用

張 琪，劉亞千，郝好杰，劉杰杰，陳 華

解放軍總醫院 基礎醫學研究所，北京 100853

乳鼠胰腺間質細胞培養上清對骨髓間充質干細胞分裂增殖的抑制作用

張 琪，劉亞千，郝好杰，劉杰杰，陳 華

解放軍總醫院 基礎醫學研究所，北京 100853

目的 探討乳鼠胰腺間質上清液是否對骨髓間充質干細胞分裂增殖產生影響。方法取出生4 d乳鼠胰腺組織進行組織培養(對第一代細胞進行干/祖性質鑒定，進行早期干/祖特性的標記OCT4、SOX2免疫熒光染色，之后進行胰腺內分泌相關的mRNA水平檢測Ngn3、PDX1、InsulinⅠ、InsulinⅡ，取上清用于誘導)。取6周齡大鼠骨髓進行間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)培養，并取第二代細胞進行誘導實驗。將上清置于BMSCs中進行誘導培養，觀察BMSCs的形態和生長分化情況。結果乳鼠胰腺中存在SOX2陽性干/祖細胞，并且具有向胰腺方向分化的Ngn3的mRNA表達，其上清影響BMSCs生長分化，但是BMSCs中未出現胰島素因子的表達。結論乳鼠胰腺間質細胞可以分泌抑制BMSCs生長分化的成分。

乳鼠；胰腺；骨髓間充質干細胞

糖尿病是以慢性高血糖為特征的代謝性疾病[1]。胰腺是與糖尿病密切相關的器官，由實質細胞和間質細胞組成，前者包括內分泌腺和外分泌腺[2]。當胰腺Beta細胞損傷時，胰腺內、外分泌腺中的干/祖細胞會分化為產生胰島素的細胞進行代償[3-4]。

骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是具有向多個胚層分化潛能的細胞，通過對糖尿病動物的靜脈、腹腔、腎包膜下輸注可以實現糖尿病的改善和治療[5-7]。而輸注的BMSCs在體內環境下發揮作用的機制尚不明確。在本實驗中我們通過乳鼠胰腺間質細胞培養判定胰腺間質是否存在定向內分泌干/祖細胞特性的細胞；通過其培養上清營養BMSCs，探討對BMSCs分裂增殖的影響，為BMSCs治療糖尿病的作用機制研究提供基礎。

材料和方法

1 實驗動物 SPF級6周齡SD大鼠6只，購自北京維通利華公司，于解放軍總醫院動物中心飼養，適應性飼養5 d后用于BMSCs培養。SPF級孕17 d SD大鼠購買、飼養同前，于生產后4 d取乳鼠胰腺用于胰腺培養。

2 LDMEM培養基配置 1 g LDMEM粉末(Gibco)溶解于1 L去離子水中，配成溶液，過濾除菌，儲存于高壓滅菌處理的玻璃容器中；取該溶液89 ml，加入10 ml胎牛血清(Gibco)，加入1 ml鏈青霉素(鏈霉素：100 μg/ml；青霉素：100 U/ml)，配成10%血清的LDMEM培養基。

3 胰腺組織培養 出生4 d SD乳鼠置于超凈臺中，3%硫噴妥鈉麻醉乳鼠，75%乙醇全身消毒3次，之后將乳鼠置于頭高腳低位，左下腹橫切口，取出胰腺置于LDMEM培養基中。將取出的胰腺組織用眼科剪剪至1 mm×1 mm大小，之后將組織分別移入15 ml離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，將組織懸浮于LDMEM培養基中，進行接種，接種密度為20 ～ 30個組織塊/皿(直徑為3.5 cm皿)，補足培養基至3 ml，之后置于37℃、5% CO2孵箱中培養，48 h后進行第一次傳代，又48 h后進行第二次傳代，期間每24 h進行一次觀察。

4 免疫熒光染色 去除第一代培養皿中培養基，迅速沿培養皿壁加入3 ml 4%的多聚甲醛固定30 min。之后PBS洗3次，每次5 min。3% H2O2封閉內源性過氧化物酶10 min，PBS洗3次每次5 min。0.5% Triton打孔20 min，PBS洗3次，每次5 min。牛血清室溫封閉30 min，去除封閉液加入胰島素一抗：兔抗大鼠(Sigma，1∶200)。OCT4一抗：小鼠抗大鼠(Abcam，1∶200)。SOX2一抗：山羊抗大鼠(Abcam，1∶200)。一抗4℃過夜后置于室溫30 min，PBS洗3次，每次10 min。加入二抗488-山羊抗兔(中山金橋，1∶200)，488-兔抗小鼠(中山金橋，1∶200)，594-兔抗山羊(中山金橋，1∶200)，避光，室溫放置1 h。hoechst33342(Sigma，2 μg/ml)避光染色5 min，PBS洗3次，每次10 min，50%甘油封片。熒光顯微鏡進行觀察。

5 引物序列 GAPDH：forward primer-CACCCTGT TGCTGTAGCCATATTC，reverse primer-GACATCA AGAAGGTGGTGAAGCAG；InsulinⅠ：forward primer-CCGTCGTGAAGTGGAG，reverse primer-CAGTTGGTAGAGGGAGCAG；InsulinⅡ：forward primer-ATGGCCCTGTGGATC CGCTT，reverse primer-CTAGTTGCAGTAGTTCTCCA；PDX-1：forward primer，GGTGCCAG-AGTTCAGTGCTAA，reverse primer-CCAGTCTCGGTTCCATTCG；Ngn3：forward primer-CT-TCACAAGAAGTCTGAGAACACCAG，reverse primer-CTGCGCATAGCGGACCACAGCTT.

6 RNA提取、PCR和瓊脂糖凝膠電泳 RNA提取：去除第一代培養皿中培養基，加入800 μl Trizol (Invitrogen)，充分裂解5 min后，收集到1.5 ml離心管，加入200 μl氯仿，10 000離心率/min離心10 min，取上清于另一離心管加入等量異丙醇，轉速同前，離心7 min，吸去上清，加入1 ml 75%乙醇同轉速離心5 min，棄上清再次1 ml 75%乙醇離心5 min，待離心管液體干燥后加入EDTA水20 μl溶解之后備用。cDNA的合成和PCR采用天真公司逆轉錄試劑盒，方法參照使用說明，PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳。

7 骨髓間充質干細胞培養 將6周齡SD大鼠頸椎脫臼處死，取股骨和脛骨置于75%乙醇中消毒3 min。將消毒后的組織于超凈臺下去肌肉使其僅剩余骨組織，剪刀減去干骺端，用含LDMEM培養基的注射器將骨髓組織沖入培養皿中，反復輕柔沖洗。將含骨髓沖洗液1 000 r/min離心5 min，棄上清，用LDMEM培養基懸浮，接種于培養皿中。于克隆出現后進行傳代，每3 d換液1次，待第一代長至培養皿面積80%時，傳至第二代。取第二代培養24 h的BMSCs用于實驗。

8 乳鼠胰腺間質細胞第一代上清誘導BMSCs 實驗組取第一代培養1 d胰腺間質細胞上清10 ml，置于上述BMSCs中，每天觀察BMSCs生長變化，對照組為LDMEM培養基組，待對照組細胞面積為培養皿80%時，取BMSCs細胞進行OCT4、SOX2、Insulin免疫熒光染色。

9 CCK-8檢測BMSC生長曲線 培養BMSC至第一代，待細胞融合至80%后，消化傳代。以每孔1×104細胞數接種于96孔板，培養24 h后去除培養基，分別加入200 μl LDMEM培養基(對照組)和第一代乳鼠胰腺間質細胞培養1 d的上清液(實驗組)，置于37℃、5% CO2培養箱中培養，在0 h、24 h、48 h、72 h分別取8孔，加入10 ml CCK8溶液，37℃孵育1 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度，繪制細胞生長曲線。

10 統計學分析 統計分析采用SPSS17.0軟件，兩組間比較采用t-test檢驗，數據用表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 乳鼠胰腺組織細胞培養可見干/祖特性細胞培養24 h進行倒置顯微鏡觀察發現：LDMEM培養基中胰腺組織周邊可見少量細胞爬出，最多可達5層，48 h最大細胞層數超過20層，故進行傳代。期間細胞形態主要為梭形，此外還有少量為扁圓形(圖1)。細胞傳至第一代后，24 h內生長迅速，48 h細胞融合達80%，細胞形態仍為梭形但有變長趨勢，扁圓形細胞比例變少。第一代細胞進行Beta細胞特異性免疫熒光染色和干細胞相關轉錄因子免疫熒光染色，結果發現胰島素、OCT4染色陰性，SOX2免疫熒光染色陽性。由此可見胰腺組織培養的細胞中具有干細胞特性的細胞(圖2)。

圖 1 原代和第一代乳鼠胰腺間質細胞形態(A、B： 50×，C、D： 100×，E、F： 200×)Fig. 1 Cell morphology of neonatal rats of P0 and P1 (A, B： 50×, C, D： 100×, E, F： 200×)

2 乳鼠胰腺間質干/祖細胞具有向胰腺內分泌細胞分化的潛能 取第一代乳鼠胰腺間質細胞提取RNA，對GAPDH、Insulin、PDX1、Ngn3的上下游引物進行反轉錄，PCR，瓊脂糖凝膠電泳。結果發現InsulinⅠ為陰性， Ngn3、 InsulinⅡ、 PDX1為陽性。其中NGn3是胰腺內分泌干/祖細胞的標記，由此可見此細胞具有胰腺內分泌干/祖細胞的特性(圖3)。

3 乳鼠胰腺間質上清能抑制BMSCs分裂增殖比較第二代BMSCs細胞和乳鼠胰腺間質細胞上清培養前后BMSCs生長情況發現：BMSCs上清組較LDMEM培養基組細胞增長速度明顯降低，并且失去了BMSCs呈漩渦狀生長的形態(圖4，圖5)。培養72 h內CCK8增殖實驗顯示，上清組BMSCs增殖明顯減少(圖6)。取共培養3 d的BMSCs進行Insulin、SOX2、OCT4免疫熒光染色，未發現陽性表達細胞。

討 論

通過我們的實驗證實了乳鼠胰腺間質中存在著向胰腺內分泌方向分化的干/祖細胞；乳鼠胰腺間質培養上清培養BMSCs會抑制其分裂增殖[8-10]。

圖 2 胰腺間質細胞第一代免疫熒光染色—SOX2(紅)和Hoechst33342(藍)； B： A圖放大Fig. 2 Immunofuorescence staining of pancreatic cells with SOX2 (red) and Hoechst33342 (blue) of passage 1; B: Magnifcation of A

圖 3 第一代乳鼠胰腺間質細胞可見Ngn3的表達Fig. 3 Ngn3 is positive in the mesenchymal cells of neonatal rats of passage 1

BMSCs移植對動物糖尿病具有改善和治療效果，關于其治療機制主要有3種推測：一是通過全身治療，MSC最終歸巢到病損局部，之后轉分化成待修復細胞；二是通過MSC分泌細胞因子的作用，這些細胞因子作用于病損部位，實現功能的修復；三是通過Beta細胞調節免疫作用[11-14]。本實驗中觀察到乳鼠胰腺組織培養上清對BMSCs生長有抑制作用，表明乳鼠胰腺間質細胞可以分泌一些能夠進入到BMSCs內的物質，影響其分裂增殖信號傳導。因此我們推測應用BMSCs移植治療糖尿病時，由于體內胰腺局部微環境的影響，定植到胰腺內BMSCs的增殖受到抑制。我們對乳鼠胰腺組織培養上清孵育3 d的BMSCs檢測，未發現胰腺相關轉錄因子的表達，這與Lee等[12]和Ezquer等[13]的觀點一致，即BMSCs發揮治療作用的機制不是通過其轉分化實現的。

圖 4 誘導前實驗組和上清組BMSCs第二代形態(A、 B：100×， C、D：200×)Fig. 4 Cell morphology of BMSCs of control and supernate group before induction (A, B： 100×，C, D： 200×)

圖 5 誘導3 d后實驗組和上清組BMSCs第二代形態(A、 B： 100×，C、D：200×)Fig. 5 Cell morphology of BMSCs of control and supernate group after induction for 3 days (A, B：100×，C, D：200×)

圖 6 BMSCs生長曲線(n=8)Fig. 6 Growth curve of BMSCs (aP＜0.01, vs control)

實驗中第一代乳鼠胰腺間質細胞是具有干/祖特性的快速增殖細胞，但是其上清卻抑制了BMSCs增殖，這說明定向干細胞和未定向干細胞所存在的微環境存在差異，為我們進一步研究細胞之間信號作用提供了指導，為研究BMSCs的作用機制提供了方向[15-16]。同時，第一代乳鼠間質細胞中干/祖特性的細胞在體外通過培養而生長存活，為進一步對于胰腺自身干/祖細胞的研究提供了基礎。

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Inhibition of supernate derived from neonatal rats in the replication of bone mesenchymal stem cells

ZHANG Qi, LIU Ya-qian, HAO Hao-jie, LIU Jie-jie, CHEN Hua
Institute of Basic Medicine, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

CHEN Hua. Email：chenhua_19641027@163.com

ObjectiveTo investigate whether the supernate of neonatal rats can infuence the growth of bone mesenchymal stem cells (BMSCs).MethodsThe infant pancreas mesenchymal cells were cultured to get the supernate, and the stem / progenitor property of passage 1 (P1) was identifed with the early marker of stem/progenitor-OCT4, SOX2 for immunofuorescence (IF) staining and pancreatic endocrine related mRNA -Ngn3, PDX1, Insulin was detected. The 2nd passage of BMSCs derived from the bone of 6-week rats were cultured with the supernate, and the morphology and property about insulin secretion of BMSCs were observed.ResultsThe SOX2 stem/progenitor with positive detection existed in the neonatal rats pancreas and showed the expression of mRNA -ngn3 differentiation to endocrine cells. And the supernate could suppress the growth of BMSCs, with no expression of insulin factor showed in BMSCs.ConclusionPancreatic cells of neonatal rats can secrete some components to infuence the mitosis of BMSCs.

neonatal rats; pancreas; bone mesenchymal stem cells

R 576

A

2095-5227(2014)07-0721-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.07.021

時間：2014-04-11 17:03

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140411.1703.006.html

2014-03-13

國家自然科學基金項目(30970418)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(30970418)

張琪，女，在讀碩士。研究方向：干細胞與糖尿病治療。Email：q15321839189@163.com

陳華，男，教授，碩士生導師。Email：chenhua_19641027@163.com