NF-κB及p38MAPK信號(hào)通路對(duì)支氣管上皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)IL-6分泌的調(diào)控作用

唐紅衛(wèi)，王成彬

解放軍總醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)科，北京 100853

NF-κB及p38MAPK信號(hào)通路對(duì)支氣管上皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)IL-6分泌的調(diào)控作用

唐紅衛(wèi)，王成彬

解放軍總醫(yī)院 臨床檢驗(yàn)科，北京 100853

目的 探討支氣管上皮細(xì)胞(bronchial epithelial cells，BEAS-2B)與中性粒細(xì)胞(neutrophils，NEU)聯(lián)合培養(yǎng)時(shí)IL-6分泌的機(jī)制。方法免疫磁珠法提取外周血中性粒細(xì)胞，建立中性粒細(xì)胞與BEAS-2B細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)體系。應(yīng)用Roche cobas e411檢測(cè)上清液中IL-6濃度。結(jié)果BEAS-2B和中性粒細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)時(shí)，上清液IL-6濃度為(3 691±482.3) pg/ml，與細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)[BEAS-2B(313.4±34.7) pg/ml；NEU(219.1±11.3) pg/ml]差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)；蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)結(jié)果顯示BEAS-2B和中性粒細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)可激活BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)NF-κB及p38MAPK的信號(hào)通路；而加入NF-κB通路抑制劑MG-132，可有效抑制上清液中IL-6的分泌[(1 075.3±83.9) pg/ml vs (3 691±482.3) pg/ml，P＜0.01]；p38MAPK通路抑制劑SB203580亦能抑制IL-6的分泌[(1 532.8±176.1) pg/ml vs (3 691±482.3) pg/ml，P＜0.01]；且MG-132的抑制效果明顯好于SB2035580[(1 075.3±83.9) pg/ml vs (1 532.8±176.1) pg/ml，P＜0.01]；當(dāng)聯(lián)合使用兩種抑制劑(MG-132和SB203580)時(shí)可進(jìn)一步減少IL-6的分泌[(353.1±33.5) pg/ml vs (1 075.3±83.9) pg/ml，P＜0.01；(353.1±33.5) pg/ml vs (1 532.8±176.1) pg/ml，P＜0.01]。結(jié)論BEAS-2B細(xì)胞與NEU細(xì)胞接觸后激活BEAS-2B細(xì)胞體內(nèi)NF-κB及p38MAPK通路，進(jìn)而調(diào)控IL-6的分泌。

支氣管上皮細(xì)胞；中性粒細(xì)胞；IL-6；信號(hào)通路；

細(xì)胞因子(cytokines，CK)可調(diào)控炎癥反應(yīng)或作為炎癥反應(yīng)的效應(yīng)分子，參與炎癥細(xì)胞的發(fā)育、成熟、分化、募集、活化的各個(gè)環(huán)節(jié)，因此在氣道炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。白介素-6(interleukelin-6，IL-6)是細(xì)胞因子大家庭的重要一員，主要由單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及淋巴樣細(xì)胞產(chǎn)生，是一種多效應(yīng)細(xì)胞因子[1-2]。在氣道炎癥發(fā)病機(jī)制中，IL-6主要作為協(xié)同因子與IL-4、IL-5、IL-13促進(jìn)B細(xì)胞分化成熟與IgE合成，但I(xiàn)L-6不能單獨(dú)使靜息的B細(xì)胞合成IgE[3-5]。一些研究表明支氣管上皮細(xì)胞與嗜酸性粒細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)可刺激IL-6的分泌，并且IL-6的分泌與NF-κB及p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)[6-7]。然而，中性粒細(xì)胞作為氣道炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，其在IL-6的分泌過程中發(fā)揮的作用卻少有研究。本次試驗(yàn)，我們重點(diǎn)探討支氣管上皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，上清液中IL-6產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)調(diào)控機(jī)制。

材料和方法

1 材料 實(shí)驗(yàn)所需靜脈血取自健康志愿者，13.8%枸櫞酸鈉抗凝；BEAS-2B細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院朱茂祥教授惠贈(zèng)；來自于正常人的支氣管上皮細(xì)胞NHBE，美國(guó)專利號(hào)：U. S. Pa.t 4885238，引進(jìn)時(shí)細(xì)胞代齡為22代。

2 儀器與試劑 Anti-CD16免疫磁珠、磁性分離器、LS分離柱(Miltenyi Biotech，德國(guó))，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(SysmexXE-2100，日本)，Cobas e411及其配套試劑(Roche，德國(guó))。Phospho-IκBα (Ser32) (14D4) Rabbit mAb、Phospho-p38 MAPK Rabbit mAb(Cell Signal Technology，美國(guó))，山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記(中杉金橋，中國(guó))，SB-203580(Selleck，美國(guó))，MG-132(Selleck，美國(guó))。

3 中性粒細(xì)胞的提取與共培養(yǎng)體系的建立 取抗凝全血20 ml，采用免疫磁珠法提取中性粒細(xì)胞，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀鑒定中性粒細(xì)胞濃度，錐蟲藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活力；取純度＞95%、活力＞90%的中性粒細(xì)胞，DMEM/F12培養(yǎng)基重懸待用[8-9]。BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，37℃，5% CO2，95%濕度培養(yǎng)，待形成單層細(xì)胞時(shí)加入中性粒細(xì)胞。抑制性實(shí)驗(yàn)中，BEAS-2B細(xì)胞和中性粒細(xì)胞預(yù)先用抑制劑SB-203580或MG-132處理1 h[10-11]。

4 IL-6檢測(cè) BEAS-2B細(xì)胞按8×104/孔接種于48孔板，待細(xì)胞融合＞95%，每孔加入5×105中性粒細(xì)胞，共孵育8 h。收集單獨(dú)或混合培養(yǎng)2 h、4 h、8 h、12 h時(shí)的各組細(xì)胞上清液，置于無菌管中，1 500 r/min，離心10 min。用Roche Cobase 411機(jī)器檢測(cè)各組上清液中IL-6的濃度。

5 Western blot檢測(cè)BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)NF-κB及p38MAPK信號(hào)通路的活性 BEAS-2B細(xì)胞按6.4×105/孔接種于6孔板中，待形成單層細(xì)胞時(shí)，每孔加入4×106中性粒細(xì)胞，共孵育15 min (p38MAPK 30 min)，收集BEAS-2B細(xì)胞。胰酶消化，收集BEAS-2B細(xì)胞[12-13]。加入RIPA高效裂解液，4℃，12 500 r/min×5 min，收集上清液，即為所提取蛋白。加入上樣緩沖液，煮沸15 min，進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后，采用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)入PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉4 h，然后加入兔源性單克隆抗體，4℃，過夜。TBST洗膜3次，加入山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記抗體，室溫1 h。洗膜3次，加入發(fā)光液，顯影。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果均以表示；各組間IL-6結(jié)果比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 免疫磁珠陽選法分離純化外周血中性粒細(xì)胞免疫磁珠陽選法分離純化中性粒細(xì)胞，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)中性粒細(xì)胞純度為97.4%，錐蟲藍(lán)染色測(cè)中性粒細(xì)胞活力＞98%。

2 上清液中IL-6的濃度 BEAS-2B細(xì)胞及NEU細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，上清液中僅分泌少量IL-6。將兩種細(xì)胞共孵育2 h、4 h、8 h、12 h時(shí)，發(fā)現(xiàn)上清液中IL-6的含量均較單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)明顯增加；且隨著共孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，IL-6的分泌量亦逐漸增加，至8 h時(shí)達(dá)峰值(圖1)；而加入NF-κB通路抑制劑MG-132，可有效抑制上清液中IL-6的分泌；p38MAPK通路抑制劑SB203580亦能抑制IL-6的分泌；且MG-132的抑制效果明顯好于SB2035580；當(dāng)聯(lián)合使用兩種抑制劑(MG-132和SB203580)時(shí)可進(jìn)一步減少IL-6的分泌。見表1。

3 BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)NF-κB、p38 MAPK的活性Western blotting結(jié)果顯示：BEAS-2B細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)Phospho-IκBα；加入中性粒細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)后，細(xì)胞內(nèi)Phospho-IκBα的表達(dá)量顯著增加，即聯(lián)合培養(yǎng)激活細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路；加入NF-κB通路抑制劑MG-132后，BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)Phospho-IκBα表達(dá)量下降(圖2A)。BEAS-2B單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)表達(dá)低水平的Phosphop38MAPK；受到中性粒細(xì)胞刺激后Phospho-p38MAPK的表達(dá)量明顯增加，而抑制劑SB-203580能有效抑制BEAS-2B細(xì)胞體內(nèi)Phosphop38MAPK的表達(dá)(圖2B)。

表1 共培養(yǎng)8 h時(shí)IL-6的分泌量Tab. 1 Level of IL-6 when BEAS-2B and neutrophils were co-cultured for 8 h

圖 1 不同共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)IL-6分泌的影響B(tài):BEAS-2B細(xì)胞；N：Neutrophils。 a：P＜0.01,與BEAS-2B細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)比較；b：P＜0.001,與BEAS-2B細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)比較Fig. 1 Effect of different co-cultured time on IL-6 secretion B: BEAS-2B cell; N: Neutrophils. a：P＜0.01, compared with BEAS-2B cells alone; b: P＜0.001, compared with BEAS-2B cells alone

圖 2 Western blot 檢測(cè)BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)NF-κB、p38-MAPK通路的活性Fig. 2 Activity of NF-κB and p38-MAPK in BEAS-2B cells detected by Western blot

討 論

氣道炎癥時(shí)，受損的支氣管上皮周圍聚集大量中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等。這些細(xì)胞相互作用，并釋放大量細(xì)胞因子(IL-6、MCP-1、GM-CSF等)參與支氣管上皮的損傷、修復(fù)和重建[14-15]。研究證實(shí)支氣管上皮細(xì)胞在IL-6的分泌過程中發(fā)揮重要作用。我們研究表明，靜息狀態(tài)下的BEAS-2B細(xì)胞及NEU細(xì)胞僅能分泌少量的IL-6，這可能與維持機(jī)體正常的生理活動(dòng)有關(guān)。當(dāng)BEAS-2B細(xì)胞接受中性粒細(xì)胞刺激后，2 h即可見上清液中IL-6含量明顯增加，并且隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，IL-6的含量逐漸上升，至8 h左右達(dá)峰值，12 h IL-6含量下降。NF-κB是轉(zhuǎn)錄因子Rel家族的重要成員，靜息狀態(tài)下與I-κB構(gòu)成異源二聚體(NF-κB/ I-κB)，而不具備生物活性。當(dāng)接受外界刺激后，可以觸發(fā)激酶活化和繼后的I-κB分子的磷酸化，后者可迅速降解并導(dǎo)致NF-κB/I-κB復(fù)合物的分離。然后活化的NF-κB異二聚體穿過核膜進(jìn)入核內(nèi)，并將κB元件與相應(yīng)基因結(jié)合導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活化。p38-MAPK通路是絲裂原活化蛋白激酶的重要成員，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動(dòng)過程中發(fā)揮重要作用，而P38-MAPK蛋白的磷酸化是p38-MAPK通路激活的先決條件。因此，為探討NF-κB及p38-MAPK通路在IL-6分泌中所起的作用，我們采用Western blot檢測(cè)BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)phosphor-IκB蛋白及phosphor-P38MAPK蛋白水平。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)培養(yǎng)的BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)phosphor-IκB蛋白及phosphor-P38MAPK表達(dá)量極低；在接受中性粒細(xì)胞刺激后，BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)IκB和P38MAPK蛋白磷酸化水平明顯增加。從而說明BEAS-2B細(xì)胞與中性粒細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)可激活BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路及p38-MAPK通路。為進(jìn)一步探明，NF-κB通路及p38-MAPK通路與IL-6分泌之間的關(guān)系，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中加入NF-κB通路抑制劑MG-132和p38-MAPK通路抑制劑SB203580。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制劑MG-132及SB203580均可減少聯(lián)合培養(yǎng)組上清液中IL-6的含量，并且MG-132的抑制效果較SB-203580好，聯(lián)合使用兩種抑制劑可進(jìn)一步抑制IL-6的分泌，使IL-6含量恢復(fù)至正常水平。這說明IL-6的分泌主要受NF-κB及p38-MAPK通路的調(diào)控，通過抑制通路的活性可減少IL-6的分泌，而且NF-κB通路在調(diào)控IL-6的分泌過程中占主要位置。

綜上所述，支氣管上皮細(xì)胞直接參與氣道炎癥過程，中性粒細(xì)胞與支氣管上皮細(xì)胞接觸后，主要通過激活支氣管上皮細(xì)胞內(nèi)的NF-κB、p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，直接或間接調(diào)控IL-6的分泌，而NF-κB通路抑制劑、p38MAPK通路抑制劑可極大減少IL-6的分泌。因此，研究NF-κB通路抑制劑、p38MAPK通路抑制劑對(duì)控制氣道炎癥效果具有重要臨床意義。

1 Vesely DL， Hoffman B， Liebermann DA. Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling mediates interleukin-6 protection against p53-induced apoptosis in M1 myeloid leukemic cells［J］. Oncogene， 2007， 26（21）： 3041-3050.

2 邵玲俐，蘭曉梅，王成彬，等.葛根素對(duì)支氣管上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)體系中黏附分子表達(dá)的影響［J］.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2012，37（4）：308-311.

3 Hong DS， Angelo LS， Kurzrock R. Interleukin-6 and its receptor in Cancer： implications for translational therapeutics［J］. Cancer，2007， 110（9）： 1911-1928.

4 來薛，劉恩順，孫增濤.慢阻肺與白細(xì)胞介素6研究進(jìn)展［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2010，5（17）：237-239.

5 Chuang CY， Chang CH， Huang YL. Thioredoxin mediates remodeling factors of human bronchial epithelial cells upon interaction with house dust mite-stimulated eosinophils［J］. Inhal Toxicol， 2009， 21（2）：153-167.

6 Wang CB， Wong CK， Ip WK， et al. Induction of IL-6 in co-culture of bronchial epithelial cells and eosinophils is regulated by p38 MAPK and NF-kappaB［J］. Allergy， 2005， 60（11）： 1378-1385.

7 Wang Q， Guo XL， Wells-Byrum D， et al. Cytokine-induced epithelial permeability changes are regulated by the activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in cultured Caco-2 cells［J］. Shock， 2008， 29（4）： 531-537.

8 Munoz NM， Leff AR. Highly purified selective isolation of eosinophils from human peripheral blood by negative immunomagnetic selection［J］. Nat Protoc， 2006， 1（6）： 2613-2620.

9 Kassianos AJ， Jongbloed SL， Hart DN， et al. Isolation of human blood DC subtypes［J］. Methods Mol Biol， 2010， 595（5）： 45-54.

10 Ip WK， Wong CK， Lam CW. Tumour necrosis factor-alpha-induced expression of intercellular adhesion molecule-1 on human eosinophilic leukaemia EoL-1 cells is mediated by the activation of nuclear factorkappaB pathway［J］. Clin Exp Allergy， 2003， 33（2）： 241-248.

11 Wong CK， Ip WK， Lam CW. Interleukin-3， -5， and granulocyte macrophage colony-stimulating factor-induced adhesion molecule expression on eosinophils by p38 mitogen-activated protein kinase and nuclear factor-［kappa］ B［J］. Am J Respir Cell Mol Biol，2003， 29（1）：133-147.

12 Xie S， Li J， Wang JH， et al. IL-17 activates the canonical NF-kappaB signaling pathway in autoimmune B cells of BXD2 mice to upregulate the expression of regulators of G-protein signaling 16［J］. J Immunol， 2010， 184（5）：2289-2296.

13 Wong CK， Wang CB， Li ML， et al. Induction of adhesion molecules upon the interaction between eosinophils and bronchial epithelial cells： involvement of p38 MAPK and NF-kappaB［J］. Int Immunopharmacol， 2006， 6（12）： 1859-1871.

14 中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組.支氣管哮喘防治指南（支氣管哮喘的定義、診斷、治療和管理方案）［J］.柳州醫(yī)學(xué)，2012（3）：171-179.

15 文文，賴國(guó)祥.慢性阻塞性肺疾病氣道重構(gòu)的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2008，21（11）：1214-1218.

Regulation of NF - κB and p38MAPK on IL-6 induced by the co-culture between neutrophils and bronchial epithelial cells

TANG Hong-wei, WANG Cheng-bin
Department of Clinical Laboratory, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

WANG Cheng-bin. Email：wangcb301@126.com

ObjectiveTo investigate the secretory mechanism of interleukin (IL)-6 when bronchial epithelial cells were co-cultured with neutrophils.MethodsNeutrophils were isolated by immune-magnetic beads positive selection method and a system of human bronchial epithelial cells co-cultured with human neutrophils was constructed. The level of IL-6 was detected by the Cobas e411.ResultsThe level of IL-6 (3 691±482.3) pg/ml in the supernatant was signifcantly higher than the cells cultured singly [BEAS-2B (313.4±34.7) pg/ml; NEU (219.1±11.3) pg/ml], (P＜0.001). Western blotting suggested that NF-κB and p38-MAPK in BEAS-2B could be activated when BEAS-2B was co-cultured with neutrophils. The release of IL-6 could be inhibited effectively with MG-132 (the proteasome inhibitor of NF-κB) [(1 075.3±83.9) pg/ml vs (3 691±482.3) pg/ml, P＜0.01]. SB203580, the proteasome inhibitor of p38-MAPK, could also inhibit the release of IL-6 [(1 532.8±176.1) pg/ml vs (3 691±482.3) pg/ml, P＜0.01]. However, the MG-132 performed better than SB203580 in inhibiting the release of IL-6 [(1 075.3±83.9) pg/ml vs (1 532.8±176.1) pg/ml, P＜0.01]. The release of IL-6 decreased further when treated with the two inhibitors [(353.1±33.5) pg/ml vs (1 075.3±83.9) pg/ml) P＜0.01; (353.1±33.5) pg/ml vs (1 532.8±176.1) pg/ml, P＜0.01].ConclusionThe signal transduction pathway of NF - κB and p38MAPK in BEAS-2B can be activated, which can regulate the release of IL-6, when BEAS-2B are co-cultured with neutrophils.

bronchial epithelial cells; neutrophils; IL-6; signal pathway

R 562.25

A

2095-5227(2014)07-0730-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.07.023

時(shí)間：2014-04-01 17:42

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140401.1742.004.html

2014-03-12

軍隊(duì)醫(yī)學(xué)科研十二五重大專項(xiàng)(CWS12J021)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2013BAI17B05)

Supported by the 12th Five Years major special Projects of Chinese PLA Medical Technologies(CWS12J021); National Key Technology R&D Program (2013BAI17B05)

唐紅衛(wèi)，男，在讀碩士，技師。研究方向：免疫。Email：tanghongwei301@163.com

王成彬。Email：wangcb301@126.com