高尿酸通過miR-663下調轉化生長因子β1抑制內皮細胞遷移

于善棟，洪 權，傅 博，陳香美，吳 鏑

解放軍總醫院 腎臟病科暨腎臟疾病國家重點實驗室，北京 100853

高尿酸通過miR-663下調轉化生長因子β1抑制內皮細胞遷移

于善棟，洪 權，傅 博，陳香美，吳 鏑

解放軍總醫院 腎臟病科暨腎臟疾病國家重點實驗室，北京 100853

目的 探討高尿酸通過miR-663影響內皮細胞遷移功能的機制。方法培養人臍靜脈內皮細胞系(EA.hy926)，用600μmol/L尿酸孵育48 h，實時定量PCR檢測miR-663的水平，并檢測高尿酸患者血清中miR-663水平；利用雙熒光素酶試驗預測并驗證miR-663的靶基因；檢測高尿酸條件下內皮細胞中轉化生長因子β1(transforming growth fator beta 1，TGF-β1)的表達水平，利用miR-663抑制物、TGFB1 siRNA轉染及劃痕實驗觀察高尿酸如何通過miR-663及其靶基因影響內皮細胞的遷移功能。結果高尿酸培養條件下內皮細胞中miR-663表達水平明顯升高，高尿酸血癥患者血清中miR-663的水平也高于正常人；雙熒光素酶試驗結果表明TGFB1的翻譯水平受miR-663直接調控；高尿酸能明顯抑制細胞的遷移能力，而高尿酸條件下TGF-β1的表達水平也明顯下降，轉染miR-663抑制物后，TGF-β1表達水平升高，內皮細胞遷移能力也明顯改善，但是利用siRNA抑制TGF-β1的表達后，miR-663抑制物不能再促進內皮細胞的遷移。結論高尿酸通過miRNA-663下調TGF-β1而抑制細胞遷移。

高尿酸；內皮細胞遷移；miRNA-663；轉化生長因子β1

大量研究表明高尿酸血癥是慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)與心血管疾病(cadiovascular disease，CVD)的獨立危險因素[1-4]。而目前關于高尿酸血癥引起心血管和腎損傷的機制研究還處于初步階段，內皮細胞功能受損可能是其中的重要環節。microRNA(miR)是一類小的非編碼RNA，長度為18 ～ 22 nt，其參與了眾多生理和病理生理活動的調控[5]。已有一些研究顯示高尿酸能夠引起內皮功能損傷[6-7]。有研究表明miRNAs在某些情況下參與了內皮細胞損傷的過程，但在高尿酸條件下是否有miRNAs參與內皮細胞損傷過程尚不清楚[8]。我們前期的miRNA芯片結果顯示在高尿酸條件下，內皮細胞中有多個miRNA出現表達差異，其中miR-663表達差異最明顯，在高尿酸條件下，miR-663表達水平明顯高于正常水平。Neth等[9]報道miR-663的高表達可以引起內皮細胞一系列病理生理改變。我們利用Targetscan查找miR-663的靶基因，其中轉化生長因子β1(transforming growth fator beta 1，TGF-β1)與細胞遷移功能有關，其表達產物TGF-β1能夠促進內皮細胞遷移[10-11]。本研究對高尿酸通過miR-663調控TGFB1影響內皮細胞遷移的假說進行驗證，并為未來預防和治療高尿酸血癥引起的內皮功能損傷提供依據。

材料和方法

1 主要材料 人臍靜脈內皮細胞系(EA.hy926)(購自美國ATCC，No.CRL-2922)；脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000、Trizol試劑盒、M-MLV逆轉錄試劑盒(購于美國Invitrogen公司)；miR-663抑制物(miR-663 inhibitor)(購于美國Life Technologies公司)(Cat. # 4464084)，TGFB1 siRNA(購于美國Santa Cruz公司)(sc-44146)，miR-663模擬物(miR-663 mimics，序列AGGCGGGGCGCCGCGGGACCGC)，U6和cel-mir-39的Real time PCR引物、siRNA(購自上海吉瑪制藥技術有限公司)；定量PCR試劑盒(購自日本Toyobo公司)；TGF-β1多克隆抗體(購自美國Abcam公司)；細胞培養試劑(購自美國GIBCO公司)；雙熒光素酶報告質粒(購于美國Promega公司)；QuickChange定點突變試劑盒(購自美國Agilent Technologies公司)。

2 細胞培養 人臍靜脈內皮細胞系(EA.hy926)用含10% FBS的低糖DMEM培養基，在37℃、5% CO2、飽和濕度孵箱中培養。

3 實時定量PCR檢測miR-663的表達 細胞接種到10 cm的培養皿中，分為對照組和高尿酸組(600 μmol/L)。培養48 h后，提取細胞及患者總RNA，用miR-663特異性的反轉錄引物(5’→3’引物序列AGGCGGGGCGCCGCGGGACCGC)，U6作為細胞內RNA定量的參照物，cel-mir-39作為血清RNA定量的參照物，參照M-MLV逆轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，條件為：16℃ 30 min，42℃ 30 min，95℃ 10 min。標本置于-20℃保存備用。采用Rotor Gene3000熒光定量PCR儀行Real time PCR檢測miR-663表達情況。反應條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 4 s，57℃ 30 s，共40個循環。每組設3個復孔。以△CT值作為MicroRNA-663的相對表達量，△CT=CT663-CTU6，以2-△△CT進行差異比較。

4 雙熒光素酶報告質粒的構建與檢測 利用PCR將TGFB1(NM_000660.5)3’-UTR區包含的miR-663的結合序列(CCCCGCC Position 13-19和18-24 of TGFB1 3’UTR)克隆到雙熒光素酶報告質粒psiCHECKTM-2中，得到psiCHECK-WT-TGFB1質粒，然后利用QuikChange?定點突變試劑盒將TGFB1 3’-UTR區的與miR-663結合的核心序列突變為TTTTATT，克隆到psiCHECKTM-2質粒中，得到psiCHECK-MT-TGFB1質粒。psiCHECKWT-TGFB1、psiCHECK-MT-TGFB1分別與miR-663模擬物或miRNA control共轉染內皮細胞。每組設3個復孔。轉染48 h后，PBS液洗滌細胞2次。吸盡殘液，加入100 μl 1×PLB裂解液室溫裂解細胞15 min。取20 μl裂解上清加入96孔白板，然后加入30 μl LARⅡ，混勻后立即在熒光/化學發光儀上檢測Firefly熒光素酶活性(F值)；再加入30 μl 1×Stop&Glo溶液檢測Renilla熒光素酶活性(R值)，Renilla活性與Firefly活性的比值即為報告基因的相對表達水平。實驗共重復3次。

5 患者選擇和血清中RNA的提取 選擇2010 -2013年本院30例高尿酸血癥男性患者和30例健康男性，檢測血清中的miR-663水平。所有患者及健康者均簽署知情同意書。取靜脈血分離血清后，用TRIzol試劑盒提取血清中的RNA。

6 Western blot 用RIPA裂解液提取EA.hy926細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白變性后取40 μg進行SDS-PAGE電泳。50 mA恒流半干轉至纖維素膜，室溫封閉1 h。按照抗體說明書分別加抗TGF-β1抗體、抗β-actin抗體4℃過夜孵育。用TBST洗膜，加二抗室溫孵育1 h。洗膜后顯影，用Image J軟件分析并計算各組吸光度與β-actin吸光度的比值，獲取蛋白表達水平。

7 劃痕實驗 EA.hy926細胞接種至6孔板中，待每孔中細胞鋪滿后用白槍頭在沿著孔的直徑劃一直線。細胞分為2組，每組3個復孔，對照組用無血清的低糖DMEM培養基培養，實驗組在無血清的低糖DMEM培養基中加入尿酸，終濃度為600 μmol/L，培養12 h后在顯微鏡下觀察并用OLYMPUS DP2-BSW測量劃痕兩側細胞的距離。

8 小RNA轉染 細胞長至50% ～ 70%時進行轉染，用無血清的低糖DMEM稀釋待轉染的RNA，將待轉染的RNA與Lipofectamine 2000混勻，放置15 min后轉染細胞，在細胞培養箱中培養5 h后，更換含血清的低糖DMEM培養基繼續培養。

9 統計學處理 利用SPSS17.0.2進行統計學分析，數據以表示，用單因素方差分析比較多組間差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 miR-663表達情況 利用熒光定量PCR檢測高尿酸刺激的內皮細胞和正常培養條件下的內皮細胞中miR-663的表達水平，結果顯示高尿酸刺激的內皮細胞中miR-663表達水平明顯高于正常培養條件下的內皮細胞(P＜0.05)(圖1A)，與miRNA芯片結果一致。高尿酸血癥病人血清中miR-663的水平明顯高于正常人(P＜0.05)(圖1B)。

圖 1 高尿酸刺激的內皮細胞(A)和高尿酸血癥患者血清(B)中miR-663的表達水平 aP＜0.05，與對照組比較；bP＜0.05，與對照組比較(單因素方差分析)Fig. 1 Expression level of miRNA-663 in high UA concentrationstimulated endothelial cells (A) and hyperuricemia patients (B) aP＜0.05,bP＜0.05, vs control group(ANOVA)

2 miR-663靶基因驗證 高表達miR-663能夠引起內皮細胞一系列的病理生理變化，因此我們推測miR-663在高尿酸導致的內皮細胞功能紊亂中發揮了重要作用[9]。利用miRNA靶基因預測軟件Targetscan(version 6.2)預測miR-663的靶基因，其中TGFB1與內皮細胞的遷移功能有關，其表達產物TGF-β1能夠促進內皮細胞遷移[10-11]。為了驗證TGFB1是否為miR-663的靶基因，我們進行了雙熒光素酶試驗。實驗結果顯示miR-663模擬物可以顯著下調psiCHECK-WT-TGFB1的熒光素酶活性(P＜0.05)，而miR-663抑制物可以顯著上調內皮細胞psiCHECK-WT-TGFB1的熒光素酶活性(P＜0.05)，但miR-663模擬物和miR-663抑制物對突變質粒psiCHECK-MT-TGFB1熒光素酶活性影響不明顯(圖2)。這表明miR-663能夠特異性地與TGFB1 mRNA作用并在轉錄后水平抑制TGFB1的表達。

3 高尿酸通過miR-663調控內皮細胞遷移的機制在高尿酸條件下，內皮細胞的遷移能力明顯低于正常培養條件下內皮細胞的遷移能力(P＜0.05)，而高尿酸條件下內皮細胞TGF-β1表達水平明顯下降(P＜0.05)。當我們用miR-663抑制物抑制miR-663的表達后，TGF-β1的表達水平明顯升高，內皮細胞的遷移能力也明顯增強(P＜0.05)(圖3A)。然而，利用siRNA抑制TGFB1的表達后，miR-663抑制物無法再明顯促進內皮細胞的遷移(P＞0.05) (圖3B)。這些結果說明，高尿酸通過miR-663下調TGFB1而抑制內皮細胞遷移。

圖 2 雙熒光素酶試驗(aP＜0.05，bP＜0.05，與miRNA對照組比較Fig. 2 Dual luciferase assay (aP＜0.05,bP＜0.05， vs miRNA control group)

討 論

許多研究顯示，血尿酸水平與多種疾病，如冠心病、高血壓、糖尿病的預后呈負相關關系[12-15]。盡管已經有研究表明高尿酸能夠引起內皮功能紊亂，但是miRNAs在這個過程中是否發揮作用仍不是很清楚[6]。miR-663是高尿酸條件下內皮細胞中表達差異最顯著的miRNA，因此我們推測miR-663在高尿酸導致內皮功能紊亂過程中發揮了重要作用。本實驗利用qRT-PCR證實了內皮細胞中的miR-663在高尿酸條件下表達水平明顯高于正常培養條件下內皮細胞中miR-663的水平。通過雙熒光素酶實驗及劃痕實驗，我們證實了高尿酸通過上調miR-663調控TGFB1從而抑制內皮細胞遷移的猜測。高尿酸血癥患者血清中的miR-663水平也明顯高于正常人，這說明在高尿酸患者體內可能也存在這種現象。內皮細胞遷移在損傷修復和血管新生中發揮重要作用，根據我們的實驗結果，我們認為高尿酸血癥患者體內可能會出現血管新生受抑制和損傷修復的延遲，這種情況會導致心血管疾病及其他疾病的發生。在TGF-β1的下游，還有許多分子參與內皮細胞的遷移，PTEN是TGF-β1調控的磷酸化酶，其能夠激活一系列下游分子影響內皮細胞遷移。Choorapoikayil等[16]，Bhattacharya等[17]、Huang和Kontos[18]報道了抑制PTEN能夠激活VEGF通路促進內皮細胞遷移，而Wang等[11]和Ma等[19]報道了PTEN通過抑制AKT通路抑制細胞遷移，在高尿酸條件下TGF-β1通過何種通路影響細胞遷移還需要進一步的研究。總之，我們的研究結果闡明了高尿酸影響內皮功能的新機制，為將來預防和治療高尿酸血癥引起的內皮功能紊亂提供了新的治療思路和靶點。

圖 3 高尿酸影響內皮細胞遷移功能的機制(劃痕實驗與蛋白印跡法) A： 高尿酸通過miR-663影響TGF-β1的表達和內皮細胞遷移(aP＜0.05，bP＜0.05， 與對照組比較； B： 高尿酸條件下，miR-663通過TGF-β1調控內皮細胞遷移(單因素方差分析)Fig. 3 Scratch test and Western blot showing mechanism of high UA concentration underlying endothelial cell migration A： Effect of high UA concentration on TGF-β1expression and endothelial cell migration via miR-663 (aP＜0.05，bP＜0.05， vs control group)； B： Effect of miR-663 on migration of endothelial cells cultured with high UA concentration via regulation of TGF-β1expression (ANOVA)

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High uric acid concentration inhibits endothelial cell migration by down-regulating TGF-β1expression via miRNA-663

YU Shan-dong, HONG Quan, FU Bo, CHEN Xiang-mei, WU Di
Department of Nephrology, State Key Laboratory of Kidney Diseases, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

WU Di. Email：wudi@301hospital.com.cn

ObjectiveTo study the mechanism of high uric acid (UA) concentration underlying endothelial cell migration via miRNA-663.MethodsEA.hy926 cells were incubated in 600 μmol/L uric acid for 48 h. Serum miRNA-663 level in patients with high UA concentration was measured by RT-PCR. The miRNA-663 target gene was identifed by dual luciferase assay. TGF-β1expression level in endothelial cells was measured. Effect of high UA concentration on endothelial cell migration via miRNA-663 was detected by miR-663 inhibitor and TGF-β1siRNA transfection and scratch test, respectively.ResultsThe expression level of miRNA-663 was signifcantly higher in endothelial cells after cultured with high UA concentration than before cultured with high UA concentration. The serum miRNA-663 level was signifcantly higher in hyperuricemia patients than in normal subjects. Dual luciferase assay showed that miRNA-663 directly regulated the TGFB1 translation level. Scratch test revealed that high UA concentration signifcantly inhibited the endothelial cell migration and down-regulated the TGF-β1expression level. The TGF-β1expression level elevated and the endothelial cell migration increased after the miRNA-663 inhibitors were transfected. However, the miRNA-663 inhibitors could not promote endothelial cell migration when the TGF-β1expression was inhibited by siRNA.ConclusionHigh UA concentration inhibits endothelial cell migration by down-regulating TGF-β1expression via miRNA-663

hyperuricemia; endothelial cell migration; miRNA-663; TGF-β1

R 543

A

2095-5227(2014)07-0733-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.07.024

時間：2014-04-11 17:25

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140411.1725.007.html

2014-03-19

國家自然科學基金面上項目(31170810；81102673)；北京科技新星計劃(Z121107002512078)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(31170810; 81102673)

于善棟，男，在讀碩士。Email：alexyu_0507@163.com

吳鏑，主任醫師。Email：wudi@301hospital.com.cn