基于DPPH-HPLC技術(shù)的馬糞海膽抗氧化活性指紋圖譜初步研究

趙恒強(qiáng)，陳軍輝，耿巖玲，劉建華，王曉*

(1.山東省科學(xué)院中藥過(guò)程控制研究中心，山東省大型精密分析儀器應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014;2.國(guó)家海洋局第一海洋研究所，青島市現(xiàn)代分析技術(shù)及中藥標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266061)

中藥是多成分多靶點(diǎn)的復(fù)雜體系，如何對(duì)中藥進(jìn)行有效的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別是中藥現(xiàn)代化的重要內(nèi)容［1］。海洋中藥是中草藥的重要組成部分，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究相對(duì)滯后，也缺乏進(jìn)行質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和科學(xué)、有效的鑒別手段。因此，開(kāi)展海洋中藥的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別研究，對(duì)加快開(kāi)發(fā)海洋中藥資源具有重要意義。

化學(xué)指紋圖譜技術(shù)因能表征中藥的整體性得到普遍應(yīng)用［2－4］，但是指紋圖譜僅能表征中藥多種化學(xué)成分的差異情況，而不能確切反映中藥產(chǎn)品的藥效。如果將指紋圖譜與生物、化學(xué)活性結(jié)合起來(lái)，以反映中藥活性的成分為指標(biāo)用于中藥的質(zhì)量控制，將能更好地反映中藥的質(zhì)量。有關(guān)譜效結(jié)合指紋圖譜的研究目前已經(jīng)成為中藥質(zhì)量控制研究的熱點(diǎn)［1，5］。

抗氧化活性是中藥研究的熱點(diǎn)之一［6］，近年來(lái)，采用抗氧化活性指紋圖譜對(duì)中藥進(jìn)行質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別的探索性研究報(bào)道屢見(jiàn)不鮮［7－13］。然而，以往的研究多是以基于穩(wěn)定自由基(如:DPPH、ABTS等)-HPLC聯(lián)用技術(shù)的抗氧化成分在線篩選方法對(duì)中藥提取物進(jìn)行篩選，從而進(jìn)一步建立其抗氧化活性指紋圖譜用于其質(zhì)量控制。但是，由于該技術(shù)篩選速度快，對(duì)緩慢抗氧化成分易造成假陰性結(jié)果，不能全面反應(yīng)中藥的活性成分信息。基于穩(wěn)定自由基-HPLC聯(lián)用技術(shù)的離線抗氧化成分篩選方法因反應(yīng)時(shí)間充分，可以更好地避免假陰性結(jié)果，并且方法準(zhǔn)確度、靈敏度較高，引起了研究者的廣泛關(guān)注［14－16］。采用該篩選方法獲得的抗氧化活性成分所對(duì)應(yīng)的色譜峰作為指紋圖譜特征峰能更加全面地反應(yīng)中藥的活性成分信息。目前，有關(guān)這方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以藥食兩用的海洋中藥馬糞海膽(Hemicentrotus pulcherrimus(A.Agassiz))為研究對(duì)象，發(fā)展了基于DPPH-HPLC技術(shù)的離線抗氧化活性指紋圖譜方法，并初步用于對(duì)不同來(lái)源樣品的鑒別。研究結(jié)果為海洋中藥的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別提供了新思路、新技術(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀，配有四元泵，DAD檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器等(美國(guó) Agilent公司);KQ-400KDE型超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司);R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司);A J100型電子天平(瑞士 Mettler-Toledo公司)。AlltimaTMC18色譜柱(4.6×250mm，5 μm，美國(guó)Alltech公司)。

甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，DPPH(95%，德國(guó)Sigma-Aldrich公司)，蘆丁(95%，德國(guó)Sigma-Aldrich公司)，咖啡酸 (99%，德國(guó)Sigma-Aldrich公司)，實(shí)驗(yàn)用水為超純水(電阻率為18mΩ·cm，Milli-Q公司)。

本文采用的10個(gè)不同批次馬糞海膽樣品分別采自青島、煙臺(tái)和大連沿岸海域，采集時(shí)間為2012年8月～9月，經(jīng)山東省科學(xué)院王曉研究員鑒定，均為馬糞海膽，樣品詳細(xì)信息見(jiàn)表1。海膽樣品經(jīng)自來(lái)水沖洗干凈后，置于烘箱中55℃鼓風(fēng)干燥至干。干燥后的海膽樣品避光、密閉、常溫貯藏。

表1 馬糞海膽樣品來(lái)源Table 1 Origins of Hemicentrotus pulcherrimus samples

1.2 溶液的配制

1.2.1 DPPH 溶液的配制

準(zhǔn)確稱取DPPH標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解并配成0.1 mol/L的DPPH甲醇溶液，錫紙包裹嚴(yán)密，置冰箱中于4℃保存，使用時(shí)以甲醇稀釋至適當(dāng)濃度。

1.2.2 馬糞海膽樣品溶液的制備

精密稱取馬糞海膽樣品0.5 g，轉(zhuǎn)入25 mL具塞三角燒瓶中，加入25 mL超純水，超聲輔助提取25 min，提取溫度為室溫，將提取液過(guò)濾，并在55℃條件下進(jìn)行旋蒸至干，用水溶解并定容至2 mL，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，待用。

1.3 色譜條件

AlltimaTMC18色譜柱。流動(dòng)相:A 20mmol/L HCOONH4+0.1%HCOOH水溶液;B 甲醇。流速:0.8mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm。溫度:室溫(20 ℃)。進(jìn)樣量 20 μL。洗脫程序:0～10min，0%B;10～20min，0～5%B;20～35 min，5% ～10%B;35～45 min，10% ～40%B;45 ～55 min，40% ～100%B;55 ～70min，100%B。

1.4 抗氧化成分的篩選

取馬糞海膽水提液0.5 mL置于棕色瓶中，加入0.5 mL DPPH溶液迅速混合均勻，避光反應(yīng)20min，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后采用HPLC進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量為40 μL。以同體積的甲醇代替DPPH溶液作為空白對(duì)照，對(duì)比色譜峰面積變化情況，其中色譜峰面積明顯減小的成分為潛在的抗氧化劑。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

初步研究表明，馬糞海膽的水提物具有較好的自由基清除活性，考察了4根不同的反相色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 ×250mm，5 μm)，Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 × 250mm，5 μm)，AlltimaTMC18色譜柱(4.6 × 250 mm，5 μm)，WatersXBridgeTMC18(2.1 ×150mm，3.5 μm)對(duì)馬糞海膽水提物的分離效果。發(fā)現(xiàn)采用AlltimaTMC18色譜柱時(shí)，馬糞海膽水提物中各色譜峰分離度較高，因此選擇AlltimaTMC18色譜柱用于馬糞海膽水提物分離研究。對(duì)比了采用甲醇－水和乙腈－水作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果，表明采用甲醇－水作為流動(dòng)相時(shí)馬糞海膽水提物中各化合物具有良好的保留和分離效果。由于馬糞海膽水提物成分復(fù)雜，因此本研究采用梯度洗脫用于其分離研究。改變流動(dòng)相酸度可以減少拖尾現(xiàn)象，考察了不同類型弱酸及含量(0.1%HCOOH，0.2%HCOOH，0.1%CH3COOH，0.2%CH3COOH)的影響，發(fā)現(xiàn)采用流動(dòng)相 A 中加入0.1%HCOOH時(shí)，各峰對(duì)稱性較好。考察了流動(dòng)相中添加不同類型緩沖鹽及濃度的影響，表明流動(dòng)相A中加入20mmol/L HCOONH4時(shí)，各峰形尖銳，對(duì)稱性較好。因?yàn)樵诓煌臋z測(cè)波長(zhǎng)下，其提取物各色譜峰數(shù)量、峰高及分布均有明顯不同，所以考察了馬糞海膽水提物在不同波長(zhǎng)(190～900 nm)下的色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在254 nm時(shí)，其HPLC色譜圖色譜峰較多、且強(qiáng)度較高，因此本研究選擇254 nm用于HPLC分析的檢測(cè)波長(zhǎng)見(jiàn)圖1。

圖1 馬糞海膽水提物的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of the water extract of Hemicentrotus pulcherrimus

2.2 抗氧化成分的DPPH-HPLC篩選

用1.2.2方法制備的馬糞海膽樣品溶液采用1.3色譜條件進(jìn)行分析，按照1.4所述篩選條件對(duì)馬糞海膽水提液中的抗氧化成分進(jìn)行了篩選，結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，采用本文的方法，在馬糞海膽的水提物中篩選到了9種成分，且在反相柱上的出峰時(shí)間較短，證明其極性較大。

2.3 方法學(xué)考察

首先，對(duì)反應(yīng)前后馬糞海膽基質(zhì)中添加的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品咖啡酸、蘆丁的峰面積變化進(jìn)行了考查。反應(yīng)后標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品咖啡酸、蘆丁的峰面積分別減小為反應(yīng)前的21.19%和 39.43%，3次測(cè)定 RSD 分別為 5.82%，7.43%，說(shuō)明該篩選方法準(zhǔn)確性較高。

其次，在優(yōu)化的色譜條件下，以各抗氧化成分的色譜峰面積為考察指標(biāo)，對(duì)HPLC分析方法學(xué)分別進(jìn)行了考察。同一馬糞海膽樣品6次平行進(jìn)樣分析表明，各抗氧化成分峰面積的RSD值均低于3.35%，說(shuō)明該方法具有較好的精密度;同一馬糞海膽樣品平行稱取6份，并依次按本研究方法進(jìn)行處理、分析，各抗氧化成分峰面積的RSD值在5.43%范圍內(nèi)，說(shuō)明該方法具有較好的重復(fù)性;將同一樣品分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣分析，各抗氧化成分峰面積的RSD值在3.31% ～5.62%(n=6)范圍內(nèi)，說(shuō)明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

由此可以看出，采用基于各抗氧化成分的HPLC分析方法，具有較好的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，為指紋圖譜的建立提供了方法基礎(chǔ)。

圖2 馬糞海膽水提物與DPPH反應(yīng)前后的色譜圖Fig.2 HPLC-DAD chromatograms ofwater extractof Hemicentrotus pulcherrimus before and after reaction with DPPH free radicals

2.4 抗氧化活性指紋圖譜的建立

為進(jìn)一步考察基于DPPH-HPLC技術(shù)的離線抗氧化活性成分對(duì)海洋中藥進(jìn)行真?zhèn)舞b別的可行性，本研究將指紋圖譜與抗氧化活性結(jié)合起來(lái)形成基于抗氧化活性成分的指紋圖譜方法對(duì)海洋中藥進(jìn)行真?zhèn)舞b別。

圖3 馬糞海膽抗氧化活性指紋圖譜Fig.3 Antioxidant fingerprint of Hemicentrotus pulcherrimus

本研究以馬糞海膽水提物中篩選到的9種抗氧化成分作為共有峰用于其指紋圖譜研究。為提高樣品間的可比性，降低色譜峰峰位變化的波動(dòng)給保留值帶來(lái)的偏移，我們將色譜圖轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定而易于比較的數(shù)據(jù)表，實(shí)現(xiàn)圖譜的數(shù)據(jù)化，再以各抗氧化成分的峰號(hào)為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)峰的峰面積為縱坐標(biāo)，做成柱狀條形碼圖，更直觀地表現(xiàn)海洋藥用生物中各抗氧化成分的分布特征。本研究對(duì)在青島沿岸采集的8批馬糞海膽樣品，以各抗氧化成分的EIC峰面積為指標(biāo)，建立了基于其抗氧化活性成分的指紋圖譜(見(jiàn)圖3)。從圖中可以看出，各批次馬糞海膽樣品水提物中抗氧化成分含量分布存在相似的特征，能夠表現(xiàn)出馬糞海膽樣品的共有屬性。

2.5 不同來(lái)源樣品的相似度評(píng)價(jià)

本研究采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2004A)計(jì)算青島沿岸采集的8批馬糞海膽和分別產(chǎn)自大連、煙臺(tái)的馬糞海膽樣品的相似度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 10批樣品的相似度Table 2 Similarity analysis of 10 sets of samples

從表2可以看出，采用本文建立的基于DPPH-HPLC技術(shù)的離線抗氧化成分的指紋圖譜對(duì)不同批次、不同來(lái)源的馬糞海膽樣品的相似度計(jì)算表明:8批采自青島沿岸的馬糞海膽樣品具有較好的相似度，相似度均在0.90以上;而產(chǎn)自大連和煙臺(tái)的兩批馬糞海膽樣品的相似度較低，分別為0.78和0.84。說(shuō)明本研究的基于DPPH-HPLC技術(shù)的離線抗氧化活性指紋圖譜結(jié)合相似度分析，可以初步用于對(duì)不同來(lái)源的馬糞海膽樣品的正確區(qū)分。

3 結(jié)論

本研究初步探索了采用基于DPPH-HPLC技術(shù)的離線抗氧化活性指紋圖譜對(duì)馬糞海膽樣品進(jìn)行鑒別的可行性。結(jié)果表明，該方法結(jié)合相似度分析，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同來(lái)源的馬糞海膽樣品的正確區(qū)分。本研究在一定程度上彌補(bǔ)了HPLC化學(xué)指紋圖譜技術(shù)缺乏藥效指標(biāo)成分的不足，提高了指紋圖譜的準(zhǔn)確性和特征性，為海洋中藥的質(zhì)量控制和真?zhèn)舞b別研究提供了新方法、新思路。

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