天麻素分子印跡聚合物的吸附和識(shí)別性能研究

陳凌霄，馬秀麗，王曉，耿巖玲，高乾善，謝宏凱，紀(jì)文華*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，山東 泰安 271000;2.山東省分析測(cè)試中心，山東 濟(jì)南 250014)

分子印跡聚合物(MIPs)是指目標(biāo)分子(模板分子)、功能單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑和致孔劑在特定條件下高度交聯(lián)聚合，然后脫除模板而得到的聚合物，在形狀和結(jié)構(gòu)上保留與模板分子相匹配的空穴，因而能夠選擇性地識(shí)別、結(jié)合模板分子。MIPs擁有諸多優(yōu)點(diǎn)，如選擇性強(qiáng)、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、對(duì)環(huán)境的耐受性好、可重復(fù)利用和制備簡(jiǎn)單等，因此已逐漸成為化學(xué)和生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［1－4］，在中藥提取與分離領(lǐng)域發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

天麻素為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材天麻的主要活性成分，具有鎮(zhèn)靜催眠，抗驚厥、鎮(zhèn)痛、抗癲癇，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等作用，在臨床上多用于眩暈、頭痛及高血壓的輔助治療，效果顯著［5－7］。現(xiàn)在提取和純化天麻中的天麻素，主要依靠大孔吸附樹(shù)脂、高效液相色譜(HPLC)以及高速逆流色譜(HSCCC)等手段［8－11］。由于這些技術(shù)的固定相對(duì)天麻素缺乏選擇性，導(dǎo)致分離過(guò)程長(zhǎng)、有機(jī)溶劑消耗量大以及環(huán)境污染嚴(yán)重。因此，研究開(kāi)發(fā)對(duì)天麻素有選擇性吸附效果的填料意義重大。

在之前的研究中，He等［12］以酸性功能單體甲基丙烯酸(MAA)成功合成了天麻素表面分子印跡聚合物，并對(duì)其進(jìn)行了表征。本研究室使用新型功能單體 2，3，4，6-tetra-O-acetyl-glucopyranoside 和 1，2，3，4，5-pentafluoro-6-vinylbenzene成功合成了天麻素分子印跡聚合物，并將其用作固相萃取柱填料來(lái)提取天麻中的天麻素［13］。本文使用堿性功能單體4-vp來(lái)合成天麻素分子印跡聚合物，并對(duì)其吸附性能和識(shí)別性能進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和材料

SWPRATM55型電子顯微鏡，德國(guó)卡爾蔡司公司。天麻素(≥98%)由西安冠宇生物技術(shù)有限公司提供，4-乙烯基吡啶(4-vp)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)、偶氮二異丁腈(AIBN)采購(gòu)自阿拉丁試劑公司。甲醇和乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為去離子二次蒸餾水。

1.2 MIPs的制備

在10mL 試管中加入0.5 mmol天麻素，1.0mmol功能單體4-vp，4.0mmol EGDMA，10mg AIBN 和2 mL二甲亞砜(DMSO)，超聲脫氣15 min，然后充入氮?dú)?5 min，密封。將密封后的試管于60℃下聚合24 h，所得聚合物碾磨后過(guò)200目篩，收集過(guò)篩后的聚合物并將其放入索氏提取器中，用甲醇:乙酸(V:V)=9:1的溶液提取24 h除去模板分子，再用甲醇洗脫除去乙酸，聚合物顆粒經(jīng)丙酮反復(fù)沉降，除去細(xì)顆粒后，真空干燥24 h，即得天麻素分子印跡聚合物。空白印跡聚合物(NIPs)的制備過(guò)程中不添加天麻素，其余同上。

1.3 掃描電鏡分析

為了研究分子印跡聚合物的表面結(jié)構(gòu)特性，對(duì)MIPs和NIPs進(jìn)行掃描電鏡分析，放大倍數(shù)為10000倍。

1.4 平衡吸附實(shí)驗(yàn)

稱取10mg MIPs置于離心管中，加入2.5 mL不同濃度的天麻素水溶液(0.05～0.5 mmol/L)，在室溫下震蕩4 h后，高速離心15 min，取上清液并用HPLC檢測(cè)其中天麻素的含量。同時(shí)平行做NIPs對(duì)天麻素的平衡吸附實(shí)驗(yàn)。吸附量Qe的計(jì)算公式為

Langmuir模型(2)和Freundlich模型(3)用來(lái)評(píng)價(jià)MIPs的吸附特性。

式中，Qe為吸附平衡時(shí)MIPs吸附天麻素的量(mg/g)，Ci為天麻素水溶液的初始濃度(mmol/L)，Ce為吸附平衡時(shí)天麻素水溶液的濃度(mmol/L)，qm為理論最大吸附量，KL為L(zhǎng)angmuir平衡常數(shù)，KF為吸附劑吸附能力常數(shù)，n為Freundlich常數(shù)，n＞1.0表示有利于吸附。

1.5 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

為了考察MIPs對(duì)天麻素的吸附速率，在10mg MIPs中加入0.1 mmol/L的天麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5 mL，在室溫下震蕩10～240min后，高速離心15 min，取上清液用HPLC檢測(cè)其中天麻素的含量。Lagergren準(zhǔn)一級(jí)和二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程用來(lái)分析整個(gè)吸附進(jìn)程。

Lagergren準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程

Lagergren準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程

式中，Qe為吸附平衡時(shí)MIPs吸附天麻素的量(mg/g)，Qt為 t時(shí)刻MIPs吸附天麻素的量(mg/g)，k1為L(zhǎng)agergren準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程的吸附速率常數(shù)(min－1)，k2為L(zhǎng)agergren準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程的吸附速率常數(shù)(g/(mg·min))。

1.6 選擇性實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證MIPs對(duì)模板的選擇性，將10mg MIPs和NIPs分別置于2.5 mL 0.1 mmol/L的天麻素和葡萄糖的水溶液中，在室溫下震蕩6 h后，高速離心15 min，取上清液用HPLC檢測(cè)其中天麻素和葡萄糖的含量。

1.7 HPLC 條件

Agilent 1120高效液相色譜儀用于檢測(cè)天麻素和葡萄糖的含量。天麻素的檢測(cè)條件:色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18(5 μm，4.6 ×250mm)，流動(dòng)相乙腈:水(3:97，V/V)，流速 1.0mL/min，進(jìn)樣量 20 μL，檢測(cè)器UV 270 nm，天麻素保留時(shí)間8.40min。葡萄糖的檢測(cè)條件:色譜柱Inertsil NH2(5 μm，4.6×250mm)，流動(dòng)相乙腈:水(75:25，V/V)，流速 1.0mL/min，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)器 UV 270 nm，葡萄糖保留時(shí)間11.2 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合物的制備

圖1 天麻素、4-vp和葡萄糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of gastrodin，glucose and 4-vp

在MIPs的制備過(guò)程中，模板分子與功能單體要能夠相互作用并形成結(jié)合基團(tuán)，才能使形成的識(shí)別空穴與模板分子有較高的匹配程度。因此，選擇合適的功能單體至關(guān)重要。4-vp(圖1)是一種堿性功能單體，常用在酸性模板分子的聚合中，而且它還是一個(gè)良好的氫受體，能夠通過(guò)氫鍵、離子鍵與模板分子中的羥基或羧基發(fā)生相互作用。本次實(shí)驗(yàn)4-vp被選作功能單體。

合適的模板分子、功能單體和交聯(lián)劑配比能夠提高M(jìn)IPs的吸附效果，本次實(shí)驗(yàn)對(duì)三者的配比進(jìn)行了優(yōu)化，不同配比的平衡吸附量Qe和印跡因子α(α=Qe(MIPs)/Qe(NIPs)如表1所示。MIPs的吸附量隨著功能單體用量的增加而增加，但是NIPs的吸附量也會(huì)顯著增加。這可能是因?yàn)楣δ軉误w的增加使得聚合中存在過(guò)量的功能基團(tuán)，進(jìn)而使聚合物的非特異性吸附量增加。當(dāng)三者比例為1:4:8時(shí)，印跡因子 α值最高，因此選擇該比例來(lái)合成MIPs和NIPs。

表1 不同的模板分子、功能單體和交聯(lián)劑配比對(duì)平衡吸附量Qe及印跡因子α值的影響Table 1 Impacts of different template molecules，functional monomer and cross-linker ratio on equilibrium absorption capacity Qeand imprinting factor α

2.2 掃描電鏡分析

對(duì)MIPs和NIPs進(jìn)行了掃描電鏡分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。從MIPs和NIPs的掃描電鏡圖中可以看出，MIPs表面相對(duì)于NIPs更加粗糙多孔，這可能是由于MIPs在洗脫出模板后保留了大量與模板分子相匹配的孔穴，而NIPs沒(méi)有加入模板因此形成的孔穴較少。

2.3 平衡吸附實(shí)驗(yàn)

圖3為室溫下MIPs和NIPs對(duì)天麻素的吸附等溫線。MIPs和NIPs的吸附量都隨著天麻素濃度的增加而增加，但是MIPs的吸附量遠(yuǎn)高于NIPs。由于NIPs的吸附作用為非特異性吸附，因此MIPs比NIPs吸附量大可以認(rèn)為是MIPs中存在特異性更強(qiáng)的結(jié)合位點(diǎn)。

圖2 MIPs和NIPs掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of MIPs and NIPs

圖3 MIPs和NIPs的吸附等溫線Fig.3 Absorption isotherm curves of MIPs and NIPs

圖4 MIPs和NIPs的Langmuir線性擬合圖Fig.4 Langmuir isotherm linear fitting curves of MIPs and NIPs

Langmuir模型和Freundlich模型是描述吸附過(guò)程的經(jīng)典模型，以Ce/Qe對(duì)Ce根據(jù)Langmuir模型擬合作圖(圖 4)，得到 MIPs 方程式 y=0.104x+0.0732，R2=0.873，NIPs 方程式 y=0.0784x+0.191，R2=0.701。以ln Qe對(duì) ln Ce根據(jù)Freundlich模型擬合作圖(圖5)，得到MIPs方程式y(tǒng)=0.805x+2.023，R2=0.996，NIPs方程式 y=0.946x+1.480，R2=0.997。由于 Freundlich 模型比 Langmuir模型有更高的線性相關(guān)性，因此選用Freundlich模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。Freundlich模型適用于聚合物有多個(gè)不同吸附位點(diǎn)的情況，F(xiàn)reundlich常數(shù)n＞1說(shuō)明聚合物中存在不同的結(jié)合位點(diǎn)并且n越大聚合物中不同的吸附位點(diǎn)越多。本次實(shí)驗(yàn)MIPs和NIPs的n值分別為1.24和1.06，說(shuō)明MIPs存在多種不同的結(jié)合位點(diǎn)而NIPs的結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)單一。

圖5 MIPs和NIPs的Freundlich線性擬合圖Fig.5 Freundlich isotherm linear fitting curves of MIPs and NIPs

2.4 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

圖6為MIPs對(duì)天麻素的吸附動(dòng)力學(xué)曲線。從圖中可以看出，MIPs對(duì)天麻素的吸附量隨時(shí)間的增加而呈上升趨勢(shì)，在吸附開(kāi)始的30min內(nèi)尤為明顯(吸附量為平衡吸附量的88.38%)，50min后吸附趨于平緩，在100min時(shí)基本達(dá)到平衡。這可能是因?yàn)镸IPs內(nèi)部的孔穴分布不均勻、深淺不同。在吸附開(kāi)始時(shí)，淺層的孔穴快速吸附天麻素使得吸附速率快速增加，深層的孔穴由于空間位阻的影響使得吸附速率降低并最終達(dá)到平衡。

運(yùn)用Lagergren準(zhǔn)一級(jí)和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程對(duì)天麻素MIPs不同時(shí)間的吸附數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合(圖7)，得到準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程為y= －0.0359x－ 1.109，R2=0.943，準(zhǔn) 二 級(jí) 動(dòng) 力 學(xué) 方 程 為y=1.156x+8.020，R2=0.999，吸附動(dòng)力學(xué)的基本參數(shù)和理論吸附量見(jiàn)表2。由表2數(shù)據(jù)可以得出準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程的線性擬合相關(guān)系數(shù)較高(R2=0.999)并且由準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程得到的平衡吸附量(0.87 mg/g)與實(shí)測(cè)值(0.83 mg/g)更為接近。

圖6 MIPs的吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.6 Absorption kinetic curve of MIPs

圖7 Lagergren準(zhǔn)一級(jí)和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程對(duì)MIPs吸附天麻素的線性擬合Fig.7 Linear fitting of pesudo-first order sorption kinetcs and pesudo-second order sorption kinetics for gastrodin absorbed by MIPs

表2 MIPs吸附動(dòng)力學(xué)擬合參數(shù)與Qe(實(shí)測(cè)值)Table 2 Absorption kinetics fitting parameters and Qevalues for MIPs

2.5 選擇性實(shí)驗(yàn)

在評(píng)價(jià)MIPs的選擇性吸附性能時(shí)，選用與模板分子天麻素結(jié)構(gòu)類似的葡萄糖(圖1)作為競(jìng)爭(zhēng)物，以判定MIPs對(duì)天麻素的選擇性。選擇性因子(β=Qe(天麻素)/Qe(葡萄糖))見(jiàn)表3所示。由表中數(shù)據(jù)得出MIPs對(duì)天麻素有較高的吸附量，這說(shuō)明分子印跡聚合過(guò)程中形成了能夠識(shí)別模板分子天麻素的孔穴結(jié)構(gòu)和識(shí)別位點(diǎn)。

表3 MIPs對(duì)天麻素和葡萄糖的吸附量及選擇性因子β值Table 3 Qeof MIPs to gastrodin and glucose and selectivity factor β

3 結(jié)論

本研究以天麻素為模板，合成了對(duì)天麻素具有選擇性吸附效果的MIPs。與NIPs相比，MIPs表面粗糙多孔并且有更高的吸附容量和更多不同的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)可知，MIPs在30min即可吸附最大吸附量88.38%的天麻素，并且在100min左右達(dá)到平衡。在選擇性實(shí)驗(yàn)中，MIPs對(duì)天麻素的吸附量遠(yuǎn)大于其結(jié)構(gòu)類似物，說(shuō)明該MIPs具有良好的選擇性。本研究結(jié)果為今后開(kāi)發(fā)對(duì)天麻素有特異性吸附功能的填料，以實(shí)現(xiàn)環(huán)保、高效、快速地分離天麻素，有一定的指導(dǎo)作用。

［1］向海燕，周春山，鐘世安，等.白藜蘆醇分子印跡聚合物合成及其對(duì)中藥虎杖提取液活性成分的分離［J］.應(yīng)用化學(xué)，2005，22(7):739－743.

［2］WAN W，BIYIKAL M，WAGNER R，et al.Fluorescent sensory microparticles that“Light-up”consisting of a silica core and a molecularly imprinted polymer(MIP)shell［J］.Angew Chem Int Ed，2013，52(27):7023 －7027.

［3］SHEN X T，ZHOU T C，YE L.Molecular imprinting of protein in pickering emulsion［J］.Chem Commun，2012(66):8198 －8200.

［4］潘浪勝，劉敏敏，田紅錦，等.木犀草素分子印跡聚合物的分子識(shí)別特性及固相萃取研究［J］.高校化學(xué)工程學(xué)報(bào)，2009，2(23):360－364.

［5］孫中吉，王輝.天麻素注射液的藥理作用和臨床應(yīng)用［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19(4):1011－1013.

［6］汪軍玲，周本宏.天麻素的藥理作用和臨床應(yīng)用研究［J］.武漢生物工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，5(4):309－313.

［7］吳思鳳.淺談天麻素藥理作用及臨床應(yīng)用分析［J］.中醫(yī)臨床研究，2011，3(22):93.

［8］Li H B，Chen F.Preparative isolation and purification of gastrodin from the Chinese medicine plant Gastrodia elata by high-speed counter-current chromatography［J］.J Chromatogr A，2004，1052(1/2):229 －232.

［9］吳春敏，陳海濱.天麻中天麻素含量測(cè)定方法的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2004，29(12):1157－1159.

［10］陳琛，李新生，周建軍，等.天麻素提取純化及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展［J］.陜西理工學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2013，29(3):69－74.

［11］楊屹，唐睿，丁明玉.大孔吸附樹(shù)脂對(duì)天麻素的吸附與分離特性的研究［J］.分析試驗(yàn)室，2004，23(11):1－4.

［12］HE M Q，SONG C C，YAN Y S，et al.Synthesis and recognition of molecularly imprinted polymers for gastrodin based on surface-modified silica nanoparticles［J］.J Appl Polym Sci，2011，121(4):2354 －2360.

［13］JI W H，CHEN L X，MA X L，et al.Molecularly imprinted polymers with novel functional monomer for selective solid-phase extraction of gastrodin from the aqueous extract of Gastrodia elata［J］.J Chromatogr A，2014，1342:1 － 7.